根霉ZZ-3脂肪酶发酵条件的优化及酶学性质研究*

魏 涛 封盛雪 毛多斌 魏东芝

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450002）

·基础研究·

根霉ZZ-3脂肪酶发酵条件的优化及酶学性质研究*

魏 涛**封盛雪 毛多斌 魏东芝

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450002）

对根霉ZZ-3脂肪酶产酶条件的优化及脂肪酶酶学性质进行了研究。结果表明，250 mL三角瓶液体培养，培养基装液量100 mL，根霉ZZ-3产脂肪酶的最佳培养基为：黄豆粉3 g/100mL，（NH4）2S040.3g/100mL，MgS040.2g/100mL，K2HPO40.2g/100mL，花生油 0.3g/100mL，pH自然。在温度28℃、转速150 r/min，摇床培养时间2 d，发酵酶活力达到124.60 U/mL。对该酶的酶学性质进行了初步研究，该酶最适pH7.5，最适反应温度37℃，在pH7～9、温度低于40℃条件下酶活稳定。

根霉；脂肪酶；产酶条件；酶学性质

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是一类水解或合成长链脂肪酸和甘油形成甘油酯酯键的酶，能够催化水解、酯化、酯交换等多种类型反应，广泛应用于能源、食品、轻工、有机合成、医药等领域，具有巨大的商业和工业潜在价值。脂肪酶来源广泛，在许多动植物及微生物中均存在，而微生物脂肪酶由于种类多，作用温度及pH范围广，底物专一性高，易于大量生产及提取等优点，成为工业脂肪酶的重要来源，常见的产脂肪酶的微生物包括假丝酵母、根霉、青霉、曲霉、毛霉、假单胞菌等。

脂肪酶按其位置专一性分为无位置专一性和1，3-位置专一性两大类，其中1，3-位置专一性在酯类改性、制备营养保健油脂和特种油脂等方面具有重要用途。根霉和毛霉是产生1，3-位置专一性脂肪酶重要菌种。本文对本室保存根霉ZZ-3产脂肪酶的液体发酵条件进行优化，并研究了该脂肪酶酶学性质。

1 材料与方法

1.1 菌种

根霉ZZ-3，本实验室选育菌种。

1.2 培养基

斜面种子培养基（马铃薯培养基）。

1.3 摇瓶发酵

根霉ZZ-3斜面于28℃恒温培养箱培养3 d，待其菌丝长有大量孢子时，置于4℃冰箱保存。每次接种于250 mL三角瓶（培养基100 mL）中，恒温摇床培养。摇床设定28℃、150 r/min，主要探讨碳源、氮源、复合氮源等培养条件对根霉产脂肪酶的影响。

1.4 酶活测定

聚乙烯醇橄榄油乳化测定脂肪酶活力。反应温度37℃，pH7.0缓冲液，以每分钟水解出1 μmol的脂肪酸所需的酶量定义为一个脂肪酶活力单位。

1.5 酶学性质测定

对最佳培养条件所产生的脂肪酶进行主要酶学性质研究，包括最适温度、最适pH和热稳定性等。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对根霉产脂肪酶的影响

几种碳源（葡萄糖、蔗糖、糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、橄榄油、大豆油、花生油、油酸）对根霉生长及产酶的影响见表1。其中糖葡萄糖对菌株产脂肪酶最有利，发酵液酶活为67 U/mL。一般认为在培养基中添加油脂可以诱导脂肪酶的产生，我们选择橄榄油、大豆油、花生油和油酸作为碳源比较研究，发现橄榄油和花生油产酶量较高，发酵液酶活达到60 U/mL以上。由于橄榄油和花生油的油酸含量最高（60 g/100 g～80 g/100 g），油酸可能起到主要诱导作用。考虑到花生油成本较低，选择花生油为诱导物。在各种碳源比较时，高浓度碳源普遍具有抑制作用。

2.2 不同氮源对根霉产脂肪酶的影响

2.2.1 单一氮源的影响

以葡萄糖作碳源，比较了不同的氮源对脂肪酶产量的影响，结果见表2。由表2可见，根霉对氮源表现出高的选择性。酵母膏、玉米浆和黄豆粉发酵液酶活较高，其中黄豆粉达到80 U/mL；蛋白胨、无机氮源（NH4）2S04、NaNO3和尿素发酵液酶活较低，因此选择黄豆粉作为发酵培养基的氮源物质。

表1 不同碳源产脂肪酶的相对活性U/mL

表2 单一氮源对酶活的影响 U/mL

2.2.2 复合氮源的影响

许岩等报道：对于根霉产脂肪酶，复合氮源优于单一氮源。因此我们考察了复合氮源（有机氮源复合和有机氮源与无机氮源复合）对根霉ZZ-3产酶的影响，试验结果见表3。有机氮源复合效果不明显，有机氮源和无机氮源（NH4）2S04复合可获得较高的酶活，可达到100 U/mL，对发酵液酶活有较明显的促进作用。原因可能是无机氮源铵态氮是根霉产脂肪酶的必要离子。

表3 复合氮源对酶活的影响 U/mL

2.3 培养基正交试验优化

在单因素实验基础上，选取黄豆粉、（NH4）2S04、MgS04、K2HPO44个因素进行L9（34）正交试验以优化培养基组成，正交试验因素水平见表4，试验结果见表5。

表4 正交试验因素水平表

表5 培养基正交实验

从极差结果得出影响酶活的因素大小为RA＞RD＞RC＞RB， 即 黄 豆 粉 ＞K2HPO4＞（NH4）2S04＞MgS04。最佳组合为A3B1C2D1。优化培养基最优组成为黄豆粉3g/100mL，（NH4）2S040.3g/100mL，MgS040.2g/100mL，K2HPO40.2 g/100mL，花生油0.3 g/100mL，pH自然，在28℃、转速150 r/min，250 mL三角瓶（培养基100 mL） 摇床培养时间2 d，发酵酶活力达到124.60 U/mL。

2.4 酶的性质研究

2.4.1 热稳定性

取100 mL粗酶液置于不同温度下，每隔20 min取样测定酶活性，结果如图1。37℃下酶活比较稳定，40℃处理80 min酶活损失50%，50℃酶活几乎完全损失。

2.4.2 pH稳定性

取100 mL粗酶液，加入等体积的pH（pH5.0、6.0、7.0、8.0） 不同的缓冲液，隔一定时间测定酶活，结果见图2。在pH5.0～8.0根霉脂肪酶酶活比较稳定，其中在中性和偏碱性更稳定。pH8.0，处理60 h酶活力能够维持在90%以上。

图1 酶的热稳定性

图2 酶的pH稳定性

2.4.3 最适反应温度

测定了33℃～47℃范围内该根霉脂肪酶的相对酶活力，结果见图3。在37℃时，该酶表现出最高酶活力；在33℃和47℃，该酶酶活最低，与酶的热稳定性相一致。

图3 温度对酶活的影响

2.4.4 最适反应pH

配制一系列pH不同的缓冲液，测定根霉所产脂肪酶的最适pH值。试验测定了该脂肪酶在pH6.0～9.0范围内相对酶活，结果见下页图4，脂肪酶的最适pH为7.5。

3 结论

图4 pH对酶活的影响

根霉ZZ-3产脂肪酶最佳培养基为：黄豆粉3g/100mL，（NH4）2S040.3g/100mL，MgS040.2g/100mL，K2HPO40.2 g/100mL，花生油 0.3 g/100 mL，pH自然。在温度28℃、摇床转速150 r/min，250 mL三角瓶装液量100 mL，培养时间2 d，发酵液酶活力达到124.60 U/mL。有机氮源和无机氮源复合可获得较高的酶活，而有机氮源复合效果不大。油酸具有较好的诱导效果。该脂肪酶最适pH7.5，最适反应温度37℃，在pH7～9、温度低于40℃表现稳定。对根霉ZZ-3所产脂肪酶的酶学性质研究表明，该酶在食品、医药和油酯化工等领域具有广阔的应用前景。

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Production conditions and enzymatic properties of lipase from rhizopus ZZ-3

WEI Tao*FENGSheng-xue MAODuo-bin WEI Dong-zhi
（College offood science and engineering，Shanxi agricultural university，Taigu 030801，China）

In this paper the production conditions of lipase from Rhizopus ZZ-3 were optimized and its enzymatic properties were studied.The results indicated that the suitable conditions for lipase production from Rhizopus were as the follows： soypowder 3 g/100mL，（NH4）2S040.3 g/100mL，MgS040.2 g/100mL，K2HPO40.2 g/100mL，soybean 0.3 g/100mL，pH natural.The highest lipase activity was 124.60 U/mL on the condition of 28℃，150 r/min.The properties of the lipase was also characterized.The optimal temperature and pH of lipase was 37℃and 7.5.The lipase was relativelystable in pH range of7-9 and at 40℃.

rhizopus；lipase；productions oflipase；enzymatic properties

TS201.2+5

A

1673-6004（2011）02-0020-04

* 项目资助：河南省重点科技攻关项目资助（102102210063）；郑州轻工业学院博士科研基金（000544）。

**魏涛，男，1980年出生，2008年毕业于山东大学微生物学专业，讲师。

2011-03-25