抗鸡球虫病药物及其耐药性现状

李佩国，李蕴玉，贾青辉，张艳英，张香斋，张文香

(河北科技师范学院动物科技学院，河北 秦皇岛，066600)

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属球虫寄生于鸡的肠道不同部位所引起的以腹泻、血便、生长迟缓、饲料转化率降低、死亡为特征的寄生虫性疾病，每年全世界因该病造成的损失高达80亿美元［1］。因球虫在鸡体内发育的复杂性和特殊性，使得球虫的免疫性较其他生物的免疫性更为复杂，在养鸡生产中球虫疫苗因其稳定性差、弱毒返强等原因而受到限制，因此防治鸡球虫病仍以化学药物为主。但因抗球虫药物的长期使用，不可避免地导致耐药虫株的产生。迄今为止，几乎所有的抗球虫药均有耐药虫株的出现，且表现出对与该药同类或作用机理相同的其他药物产生一定程度的交叉耐药性［2，3］。由于地域的差别，用药习惯的不同，各地的耐药谱也不尽相同。因此，在制定抗球虫方案时，很重要的一点就是要了解目前可用的抗球虫药对养鸡场的艾美耳球虫的野毒株的药效。由于球虫耐药性普遍存在且危害巨大，为此，各国的科学家，尤其是美国、英国等科学家对耐药性的机理进行了大量的调查研究，但至今均未能阐明鸡球虫耐药性是如何产生和发展的。

1 抗鸡球虫病药物种类

自Levine［4］发现磺胺类药物对鸡球虫病有疗效，Grumbles［5］首先用磺胺喹噁啉预防鸡球虫病以来，又陆续发现呋喃类、生物碱类、离子载体类等药物用来防治球虫病。迄今防治鸡球虫病的药物已达50多种，但有些药物因毒性太高或疗效不佳而被淘汰。目前仍应用生产的抗球虫药有20余种，按其化学结构和生产过程大致可分为聚醚离子载体类和化学合成类抗球虫药。

1．1 聚醚离子载体类抗球虫药

1．1．1 莫能霉素 别名瘤胃素、莫能菌酸、欲可胖，是肉桂地链霉毒菌的发酵产物，也是第1个被用于抗球虫作用的离子载体药物，推荐剂量为100～121 mg/kg，1971年开始投放市场，在20世纪80年代，曾一度达到80%的市场占有率［6］。莫能霉素与泰妙霉素、竹桃霉素存在配伍禁忌;高剂量使用可引起肉仔鸡生长严重受抑，甚至中毒死亡;产蛋鸡禁用。

1．1．2 盐霉素 又称沙利霉素，商品名为优素精、赛可喜，是日本科研制药株式会社的研究者在1978年于白色链霉菌的培养物中首先发现的聚醚类抗生物质，推荐剂量为40～60 mg/kg。它是我国最早引进的离子类载体类抗球虫药，对堆型艾美耳球虫效果较好，对柔嫩、巨型和布氏艾美耳球虫效果较弱，具有明显的促生长效果，价格低廉。因该药能使蛋壳质量和产蛋量下降，故不宜应用于产蛋鸡。

1．1．3 那拉霉素 又称甲基盐霉素，推荐剂量为54～72 mg/kg，1985年上市。其化学特性和离子载体活性与盐霉素非常相似，与盐霉素和莫能霉素的功效相近，与尼卡巴嗪联合使用，可降低尼卡巴嗪的毒性。

1．1．4 马杜霉素 又名加福、杜球、克球皇、抗球王，是美国氰胺公司从马杜拉放线菌的培养液中提取的一种聚醚抗生素，推荐剂量为5～6 mg/kg，1984年在巴西上市，1989年在美国注册使用，后又在拉美和欧共体各国相继出现，是目前我国市场占有率最高的离子载体类抗球虫药。但安全范围窄，剂量超过6 mg/kg或长期使用会抑制生长，使用不当容易引起中毒。

1．1．5 拉沙里霉素 又名球安，是由拉沙里链霉菌培养物中分离得到的唯一的一种双价离子载体类抗球虫药，推荐剂量为75～125 mg/kg，1974年上市，对柔嫩艾美耳球虫效果较好。但产蛋鸡禁用，鸡服该药后要大量饮水，易使粪便变稀，使其应用受到限制。

1．1．6 海南霉素 是中国医科院上海药物研究所的科技人员从海南岛土壤中的稠李链霉菌东方变种的培养物中获得的第1个具有知识产权的原创性防治鸡球虫病专用药物，也是迄今为止我国唯一批准上市的属一类新兽药的抗球虫药，1994年正式列入我国的饲料添加剂允许使用的品种目录。试验证明该药是一种高效抗球虫药物，其预防效果明显优于治疗效果［7］，且对某些离子载体类抗生素已产生耐药的虫株也有较高疗效，还能提高饲料的转化率和促进生长发育。

各种离子载体类抗球虫药的作用机理是相似的，即通过结合Na+，K+，Ca2+或Mg2+等阳离子形成脂溶性复合物后进入子孢子或裂殖子内，细胞内阳离子大量堆积，破坏正常渗透压，最终导致虫体破裂致死。它们主要作用于侵入期虫体(子孢子，第1代第2代裂殖子)，不仅抗球虫谱广，且耐药性产生慢等特点，成为目前应用最广泛的抗球虫药。

1．2 化学合成类抗球虫药

1．2．1 磺胺类 主要包括磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲基嘧啶，是第1个被广泛用于防治球虫病的药物。其作用机理是与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，阻止二氢叶酸合成，最终影响核蛋白质的合成，实现抑制球虫的目的。因该药主要影响球虫的裂殖，因此，治疗时须采用足够的剂量和连续用药才能有效，否则球虫易产生耐药性。但如能合理配伍，磺胺类不但能够抑制球虫耐药性，而且对混合细菌感染也有疗效。因磺胺类药物的生产制造过程中对环境造成严重污染，日本等国家禁止生产此类药物。

1．2．2 酰胺类 主要是球痢灵，即二硝托胺，是20世纪60年代上市的老药，80年代开始在我国普遍使用，推荐剂量为125 mg/kg。球痢灵对球虫的第2代裂殖体生殖有抑制作用，其作用的峰期是在感染后的第3 d，对卵囊孢子形成也有作用。该药不会影响鸡球虫免疫力的产生，故适用于肉鸡和蛋鸡，并且有显著地促进肉鸡增重和提高饲料转化率的作用。

1．2．3 吡啶类 主要是克球粉，即氯羟吡啶，是20世纪80年代中期在国内上市的化学合成抗球虫药，推荐剂量为125 mg/kg。对7种球虫均有效，主要作用于子孢子，对球虫的活性高峰期是子孢子期，即感染后第1 d，因此无治疗价值。初期使用该药时对球虫有较好的效果，但能显著抑制机体对球虫产生免疫力，而且球虫对该药极易产生耐药性。据报道，氯羟吡啶对小鼠的体细胞和生殖细胞有弱致突变作用。

1．2．4 胍类 主要是氯苯胍，是我国研制的第1个专用抗球虫药，20世纪80年代初已上市应用，推荐剂量为30～60 mg/kg。对球虫裂殖体、配子体及卵囊有抑制作用。其作用机理是干扰蛋白质的形成，不影响鸡对球虫免疫力的产生，但最大的缺点是66 mg/kg剂量可引起鸡蛋和肉品氨臭味，影响鸡肉的品质。该药上市早，有些地方已停用。

1．2．5 喹啉类 主要包括苯甲氧喹啉、癸氧喹啉和丁氧喹啉3种，苯甲氧喹啉的药效比癸氧喹啉强2倍，比丁氧喹啉强10倍。该类药作用机理为破坏球虫线粒体内细胞色素体系的电子运输，抑制球虫的呼吸作用，使球虫不能正常发育。此类药品的用药成本较高，极易产生耐药性，应用价值有限。目前欧盟地区已开始禁用任何一种喹诺啉类抗球虫药。

1．2．6 抗硫胺素类 主要是氨丙啉，推荐剂量为100～125 mg/kg，其化学结构与硫胺素(VB1)相似，是硫胺的拮抗剂，其抗球虫作用可能是竞争性地抑制虫体硫胺摄取而导致硫胺缺乏，妨碍虫体内的糖代谢过程，从而抑制了球虫的发育。作用的高峰在球虫生活史的第3 d，主要作用于第1代裂殖体，阻止形成裂殖子，对有性繁殖和子孢子也有一定的抑制作用。其特点是对鸡各种球虫均有效，尤其是对第1代裂殖体特别有效，可有效地控制球虫病的发生。此外，该药毒性小，安全范围大，使用后不影响鸡对球虫产生免疫力。氨丙啉常与乙氧酰胺苯甲酯联合使用，通过乙氧酰胺苯甲酯干扰球虫叶酸合成途径产生广谱作用。

1．2．7 均苯脲类 仅尼卡巴嗪一种，是国际上最早研制成功的专用抗球虫药，推荐剂量为20～25 mg/kg。它主要对球虫第2代无性周期的裂殖体(周期第4 d)有抑制作用，具有广谱、高效和产生耐药性慢等优点，对其他抗球虫药耐药的球虫使用本品仍有效，在我国东南部的使用相当普遍。该药的缺点是导致鸡厌食，抑制鸡的生长，炎热的夏季可加重鸡的热应激反应而导致死亡，故在夏季应谨慎使用。但尼卡巴嗪有良好的配伍性，通过配伍可以克服其缺点［8］。

1．2．8 植物碱类 主要是常山酮，由法国Roussel-Uclaf公司开发生产，其商品名为速丹，它是从中草药常山中提取出的常山碱的衍生物。常山酮对球虫发育周期中的3个阶段即子孢子、第1代裂殖体和第2代裂殖体都能发挥杀死作用，使早期病变不继续发展，保持肠道正常吸收功能，是一种广谱高效杀虫药，3 mg/kg常山酮即可杀死肉鸡柔嫩、毒害、巨型、堆型、变位和波氏艾美耳球虫，且停药后无复发现象。常山酮主要优点是毒副作用小，安全范围大，在组织中代谢很快，并随粪便排出体外，肉品和内脏中几乎没有药物残留。因化学结构独特，与其他抗球虫药无交叉耐药性。但国内目前尚无常山酮工业化报道，产品主要依靠进口，价格昂贵，使其应用受到了一定的限制。如果常山酮的成本能够降低，应用前景广阔［9］。

1．2．9 三嗪类 主要是地克珠利与妥曲珠利。地克株利属三嗪苯乙腈化合物，该药1986年由比利时杨森公司研制开发，目前已在美国、德国等40多个国家上市，我国于1997年获准生产，现在已有多家工厂生产，推荐剂量为1 mg/kg。妥曲珠利是德国拜耳公司20世纪80年代开发的三嗪酮类抗球虫药物，国内称为百球清。这类药是化学合成药中最优秀的一类，具有广谱、高效、低毒的特点，是目前用药浓度最低的一类抗球虫药。地克珠利可能影响球虫核酸的合成，它可允许裂殖体与小配子体核的正长生长与分裂，但却阻止其进一步分化，使得裂殖生殖或配子生殖不能正常完成。其抗球虫活性既可表现在无性生殖阶段，也可表现在有性生殖阶段。妥曲珠利可在球虫正常发育阶段诱导虫体细胞内质网和高尔基体发生膨胀，从而使细胞核周围空间的分布发生异常。同时，妥曲珠利还抑制球虫呼吸链酶活性，抑制球虫细胞线粒体内氧化磷酸化作用，结果导致球虫的呼吸作用受阻，从而影响虫体的正常新陈代谢，导致球虫死亡。其缺点是半衰期短，需要连续用药，但又易产生耐药性。费陈忠等［10］在地克珠利结构的基础上，合成并筛选出高效安全的新型三嗪类抗球虫化合物—纳川珠利，有望开发成为一种新的抗球虫药物。

2 抗球虫药耐药性现状分析

2．1 聚醚离子载体类抗球虫药的耐药性

起初，人们认为球虫对聚醚离子载体类药物不会产生耐药性，但此论断很快即被否定。因国内外研究者纷纷从田间分离到了耐药性虫株，如Badrnik等［11］从田间分离出了对莫能菌素失去敏感性的柔嫩艾美耳球虫。Urara等［12］报道，田间分离的大部分球虫虫株对马杜霉素和盐霉素有全部和部分的耐药性。而国内的球虫耐药性则更为严重，不仅耐药谱宽，且多重耐药和交差耐药明显。如孔繁瑶等［13］用田间分离的15株柔嫩艾美耳球虫进行实验室检测，结果表明80%的虫株对莫能菌素失去了敏感性。汪明等［14］对从北京、天津、山东和广东4省市10个鸡场分离的10株柔嫩艾美耳球虫进行了调查，结果发现30%虫株对马杜霉素有耐药性，40%虫株对拉沙里菌素有耐药性，70%虫株对盐霉素有耐药性。韩谦等［15，16］和刘群等［17］证实山东聊城、诸城及潍坊地区的鸡混合球虫对盐霉素、拉沙里菌素、莫能霉素、马杜霉素均存在不同程度的耐药性。曾明华等［18］报道，柔嫩艾美耳球虫合肥野外株对盐霉素、莫能菌素和拉沙菌素的抗球虫指数(ACI)全部低于160。对广东省柔嫩艾美耳球虫耐药性的调查表明，马杜霉素耐药比例为95．2%，而盐霉素、拉沙霉素和森杜拉霉素的耐药虫株比例为100%［19］。黄兵等［20］对上海地区鸡球虫耐药程度进行了调查，发现莫能菌素完全耐药性的比例高达67%～80%，马杜霉素中度耐药和完全耐药的比例达到50%。顾有方等［21］报道，柔嫩艾美耳球虫南京株和宣城株对马杜霉素已产生不同程度的耐药性。徐金俊等［22］报道，柔嫩艾美耳球虫扬州分离株对盐霉素、马杜霉素具有完全耐药性。张香斋等［23］等报道，秦皇岛株柔嫩艾美耳球虫对马杜霉素呈现轻度耐药，而唐山株则表现完全耐药。魏峰等［24］报道，长春市柔嫩艾美耳球虫分离株对莫能菌素无耐药性，对马杜霉素有中度耐药性，对盐霉素有完全耐药性。

一般认为该类药物的作用机理相似，在球虫对一种药物产生耐药性以后，也会对此类的其他药物敏感性降低，即产生交叉耐药性，但此类报道不一致。如1989年Raether试验发现马杜霉素、莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素、拉沙里菌素之间存在高度交叉耐药性。而同年Bedrik试验表明马杜霉素能有效控制其他几种离子载体抗生素药物已产生耐药性的虫株，拉沙里菌素可以控制对莫能菌素和甲基盐霉素已产生耐药性的虫株［11］。安健等［25］和王黎霞等［26］试验证明马杜霉素也能控制对莫能菌素和盐霉素有耐药性的虫株，表明离子载体类间有不完全的交叉耐药性。

2．2 化学合成类抗球虫药耐药性现状分析

化学药物虽然多数疗效较好，但有些也易产生耐药性。早在1945年美国就从野外分离到了怀疑对磺胺类药物具有耐药性的虫株，1954年又从鸡场分离出对磺胺类药物有耐药性和无反应的虫株。英国的Hemsley分离到耐氨丙啉的布氏艾美耳球虫的虫株和分别耐球痢灵和尼卡巴嗪的柔嫩艾美耳球虫虫株。法国的Hamet分离到了耐常山酮堆型、柔嫩艾美耳球虫虫株。在国内，彭新宇等［19］发现球净对广东省柔嫩艾美耳球虫野外分离株的耐药比例最低(13．6%)，其次为氯苯胍(75%)、地克珠利(82．2%)、球痢灵(88．8%)，对氯羟吡啶、氨丙啉的耐药虫株比例为100%。李佩国等［27］的调查表明，柔嫩艾美耳球虫秦皇岛株对力克球(有效成分:磺胺喹噁啉钠)中度耐药，对球敌(有效成分:地克珠利)轻度耐药，而对氨丙啉则无耐药性。2008年又进一步试验表明，该虫株对尼卡巴嗪和氨丙啉呈现轻度耐药，对克球粉、瑞冠球和金三特呈现中度耐药，对球敌呈现完全耐药性［23］。徐金俊等［22］报道，柔嫩艾美耳球虫扬州分离株对甲基三嗪酮敏感，对氨丙啉具有中等耐药性，对球痢灵、氯羟吡啶、尼卡巴嗪、地克株利具有完全耐药性。肖寒等［28］报道，安徽部分地区的7种艾美耳球虫对地克珠利和托曲珠利具有重度耐药性，对尼卡巴嗪、磺胺喹噁啉钠和磺胺氯吡嗪钠具有中度耐药性。柔嫩艾美耳球虫长春分离株对妥曲珠利无耐药性，对尼卡巴嗪有轻度耐药性，对地克珠利有中度耐药性，对氯羟吡啶和盐霉素有完全耐药性［24］。目前，国内也在实验室分别诱导了抗氯嗪苯乙氰［29～31］、氯羟吡啶［29］和常山酮［30］等的耐药株。

3 球虫耐药机理探讨

由于球虫耐药性普遍存在且危害巨大，自20世纪50年代以来，各国的科学家，特别是英国、美国等科学家对球虫耐药性的机理进行了大量的调查研究，但至今都未能阐明鸡球虫耐药性是如何产生和发展的。Chapman［32］认为球虫耐药性因原来就存在于球虫群体中的突变个体多次重复选择的结果。Chapman［33］用柔嫩艾美耳球虫进行诱导试验，继代16次便产生了对莫能菌素有耐药性的虫株。Tamas［34］用(1～5)×10－6马杜霉素做诱导实验，经14代诱导出对5×10－6马杜霉素有耐药性的柔嫩艾美耳虫株。在国内，安健［35］也诱导分离出18次继代后的马杜霉素耐药株。余丽芸等［36］经过15次继代，诱导产生了对135 μg/g拉沙里菌素的耐药性虫株。韩红玉等［37］采用药物浓度逐渐递增的方法，以0．05×10－6地克珠利和2．0×10－6马杜霉素为起始诱导浓度，分别经过18次和20次传代，在实验室诱导了柔嫩艾美耳球虫对地克珠利和马杜霉素的耐药性虫株。这种突变体的产生可能是因球虫与药物接触后所致的适应性，也可能是由于其自身发生突变。Jeffers［38］曾设想球虫耐药性的产生是因虫体基因发生的突变。安健等［39］采用RT-PCR方法，以柔嫩艾美耳球虫总RNA反转录的cDNA为模板能够鉴别出马杜霉素耐药虫株和3株马杜霉素敏感株，其鉴定结果与鸡体试验结果一致，说明敏感株和耐药株在序列AGD5上的差异发生在转录水平。韩红玉等［40］利用抑制消减杂交技术(SSH)，通过2轮杂交和2次PCR分别构建了富含两个耐药株与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。经比较发现，有4个新的cDNA片段可能与地克珠利耐药株的产生有关;有3个新的cDNA片段可能与马杜霉素耐药株的产生有关。2006年韩红玉等［41］又采用银染mRNA差异显示技术(DD-PCR)，发现地克株利耐药虫株和马杜霉素耐药虫株分离的差异片段中都有2个cDNA片段，经初步鉴定可能与柔嫩艾美耳球虫的耐药性有关。Zhu等［42，43］利用SDS-PAGE技术对柔嫩艾美耳球虫敏感株WIS(0)和莫能菌素耐药株WIS(1)，WIS(5)，WIS(25)之间蛋白质水平上进行了比较，结果表明耐莫能菌素株具有4个超表达的蛋白质，其条带随耐药程度的增加而逐渐清晰，这些超表达的蛋白质可能与球虫对莫能菌素产生了耐药性有关。刘文江等［44］用2-DE法比较了柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜霉素耐药株第2代裂殖子蛋白质表达图谱，通过分析发现了耐药株和敏感株之间有一些表达差异的蛋白质斑点。相关研究证明耐药性球虫株已发生了蛋白质水平上的变化，而且蛋白质是基因表达的产物。生物体之所以能表现出各种各样的特性，主要是由于其内部基因差异表达所致。因此，若能分离和鉴定出球虫耐药基因将有助于揭示鸡球虫病的发生机理。

4 结 论

多年来，抗球虫药物在鸡球虫病的防治中发挥了重要作用，但无论何种抗球虫药，在连续使用一个时期后，都不可避免地面临着耐药性问题。由于我国地域的差别，用药习惯的不同，各地的耐药谱也不尽相同。为指导养鸡生产合理选择抗球虫药物，提高抗球虫效果，应加强球虫耐药性的检测，及时掌握球虫对常用抗球虫药的耐药性动态，克服用药的盲目性。同时，尚需对球虫耐药性机理进一步探讨，以便为新药的开发和基因工程疫苗的研究提供理论依据。

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