水貂阿留申病研究进展

张庆明，王玉平，雷连成

(吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春，130062)

水貂阿留申病(AD)是由细小病毒科阿留申水貂病毒属水貂阿留申病毒(ADV)引起的，主要侵染水貂、病程缓慢的传染性疾病。阿留申病毒对水貂的健康有严重的影响，能够使水貂呈现多种不同的临床症状。新生水貂表现为急性肺炎，成年水貂则表现为伴有高γ－球蛋白和肾小球肾炎等症状的慢性免疫系统失调。ADV主要侵染水貂，不仅感染阿留申基因型水貂，其他所有基因型的水貂都易感，只是非阿留申型水貂的症状较轻。

1 病原学

水貂阿留申病毒(ADV)属于细小病毒科，阿留申水貂病毒属，无囊膜，直径22～25 nm，不含脂质和糖类，结构坚实，为单链线性DNA病毒。该病毒因其坚实紧密的形态结构而对外界物理化学因素的抵抗力非常强。能抵抗乙醚和氯仿，且耐热，80℃时可存活1 h，90℃时可耐受10 min，100℃ 3 min仍能保持感染性。在5℃时，福尔马林体积分数为0．03的溶液约2周处理仍有活力，耐受4周才灭活。在pH 2．8～10．0的环境中均能保持活力，但蛋白酶处理时，病毒滴度明显下降。可被紫外线、0．5 mol/L的盐酸、5 g/L的碘溶液及20 g/L的氢氧化钠溶液灭活［1～4］。

Porte等［5］证明，阿留申病病毒可以在他们所试验的39种细胞中的5种水貂细胞株、一种非洲绿猴肾细胞和人的细胞株WI－38中有限地产生阿留申病毒抗原。在感染后2 d，抗原发现于核内，在感染后3～4 d，小量的抗原有时也见于胞浆内，通常仅1%的细胞含有抗原，感染4 d以后，则难以检测到抗原。1977年，Hahn等［6］在猫肾细胞系CRFK内，通过免疫荧光方法确定核内存在病毒抗原。1980年，Bloom等［7］报道阿留申病病毒(ADV－G)在31．8℃的条件下可于CRFK细胞内增殖。

2 分子生物学

1988年，Bloom等［8］完成了ADV－G亚型的基因序列测定，其基因共包含4 801个核苷酸。基因组的两端均存在回文序列，并形成发夹结构，共有4个编码蛋白的开放阅读框架(OFR)，分别为:左开放阅读框架(L－ORF)、右开放阅读框架(R－ORF)和2个短的可编码小于10 ku多肽的中间开放阅读框架(MORF1 和 MORF2)。L－ORF 对应非结构蛋白1(NS1)，R－ORF 对应结构蛋白1，2(VP1，VP2)，M－ORF对应其他非结构蛋白。

ADV的复制位点位于细胞核中，发生于宿主细胞的复制间期(S期)［9］。ADV－G在CRFK细胞中复制时，由位于3MU的启动子(P3启动子)启动合成Rl，R2，R2′，和RX等4种mRNA，而位于36MU的P36启动子负责启动R3mRNA的合成。

3 发病机理

从1940年发现AD以来，国内外学者针对AD的发病机理进行了大量的研究工作。基于目前国内外学者的研究结论，ADV感染所造成的宿主动物的损伤主要可归结为两个方面:

阿留申病是典型的免疫复合物病。动物体感染ADV后，体内存在高滴度的抗病毒抗体，但病毒并不被IgG中和。在慢性感染水貂血清中的阿留申病病毒虽被抗体结合，但不能被中和，病毒也不从宿主体内被清除出去。这些免疫复合物在血液中循环，沉积于肾小球及其它器官动脉管壁的基底膜，引起肾小球及其它组织的损害，病理表现为肾小球肾炎及动脉血管炎等。

巨噬细胞为ADV侵染的靶细胞。ADV对巨噬细胞的侵染，引发了宿主动物免疫机能紊乱。巨噬细胞作为参与机体免疫应答的主要免疫细胞之一，ADV在其体内的复制，必将对其功能产生一定的影响。而巨噬细胞功能紊乱所引发的连锁反应，可能最终导致浆细胞增多和高水平γ－球蛋白的出现。

4 诊 断

阿留申病的实验室诊断包括以下几个方面:

4．1 病原学检查

1976年，Brummerstedr，E［10］在电子显微镜下发现有2种不同颗粒，典型的病毒颗粒约22～24 nm，而较小的颗粒为10～12 nm，这种较小颗粒可能为铁蛋白。常国权等［11］采用直接电镜和胶体金免疫电镜技术对疑似病料进行了检测。对二者检测结果比较后认为，前者杂质较多，成像不清晰，而后者则简单快速，敏感特异，而且可以对病毒在细胞内进行定位。阿留申病毒能在睾丸细胞和肾细胞、鼠和鸡胚等原代细胞上生长，也可在猫肾细胞上繁殖并产生细胞病变。但病原学的检测多用于实验研究，很少应用于临床。

4．2 血清学检查

目前在水貂阿留申病研究的检疫技术中以血清学诊断尤为重要。

4．2．1 碘凝集试验(IAT) 该方法是根据病貂血清中γ－球蛋白显著增多，遇到碘试剂可以发生凝集反应的原理而设计的。但该方法特异性差，结核病及其他肝肾疾病均呈现阳性，因此该法始终未能普及。

4．2．2 对流免疫电泳试验(CIEP) 该方法是利用特异性阿留申病毒抗原(组织抗原或细胞抗原)能与被检水貂血清中抗体进行反应的原理设计的。在电场力作用下，抗原由阴极向阳极迁移，而抗体则反向运动，在琼脂糖凝胶中抗原和抗体结合成清晰的灰白色沉淀线则证明为阳性。

4．2．3 淋巴细胞酯酶标记 林学岷等［12］采用ANHE染色法对健康貂和患病貂做了T，B淋巴细胞的测定试验。结果表明，AD水貂的T，B淋巴细胞与健康水貂的T，B淋巴细胞值差异明显，T淋巴细胞明显降低。据B．Aasted等［13］报道，B淋巴细胞呈ADV的最初靶细胞，使ADV复制进入转化阶段，致使感染的B淋巴细胞大量增生和分化。因此，淋巴细胞酯酶标记可作为水貂的ADV早期诊断的可靠方法。但此法目前尚未推广使用。

4．2．4 胶体金免疫层析法 胶体金免疫层析技术(GICA)是以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细管作用原理，以胶体金为标记物来显示结果的一种新型的检测技术。徐磊［14］通过水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原区的原核表达产生的抗原作为标记抗原，初步建立了水貂阿留申病胶体金层析诊断方法，并与对流免疫电泳法进行了比较，显示了较好的敏感性和特异性。

除上述几种方法外，水貂阿留申病的血清学诊断还有间接免疫荧光试验法、补体结合试验等，但因操作方法均较复杂，尚未用于兽医临床实践。

4．3 分子生物学诊断

4．3．1 聚合酶链式反应(PCR) PCR技术是利用特异性的引物对靶序列进行体外扩增的一种方法，该技术从理论上可对微量(最少可为1个核酸拷贝)的靶DNA进行扩增，用于病毒检测的准确性和特异性远超过CIEP方法。对于母貂分娩时可能出现的死胎、木乃伊胎或刚出生的幼仔，由于很难获得血清样品及可能存在的其它一些干扰因素，在实验室诊断中不能使用CIEP进行ADV抗体检测，但PCR方法可以完成这一检测工作。

由于PCR检测成本较高等因素的限制，用于ADV感染情况检测的样本数不够大，检测的结果并不一定能够十分准确地反映一个地区养殖水貂ADV感染的实际情况，仅可以对国内水貂ADV感染情况的严重性给以一定的参考。

4．3．2 基因检测芯片 朱善元等［15］根据已发表的水貂阿留申病病毒的序列，在现有的探针反相杂交技术的基础上，融合基因芯片的基本原理和核酸分子碱基互补配对的原则，制作成疾病诊断基因芯片。结果表明，基因芯片的检出率比ELISA方法高17%。该方法可克服ELISA法和碘凝集方法需要制备新鲜血清和敏感性差等问题;可在机体产生抗体之前，早期准确地检测病原，这对预防、控制水貂阿留申病疫情的蔓延十分有利;由于在每份检测样品中都设立了阴性对照和阳性对照，可有效地克服PCR易被污染的缺点。基因芯片方法可以作为鉴别水貂阿留申病的一种新途径。

5 防 治

阿留申病毒对水貂养殖业是一种严重的威胁，但是基于疫苗的保护性控制的研究尝试始终没有取得成功。因ADV的特殊的致病机理，其疫苗的研制开发一直是动物医学界很棘手的问题。ADV感染水貂后，水貂体内不产生或只产生少量的中和抗体，而产生的多数抗体不仅不能中和病毒的毒力，反而通过介导抗体依赖性增强作用，进一步帮助ADV对靶细胞的侵染。由于病毒抗原与抗体形成的复合物特有的理化特点可导致免疫复合物逃避巨噬细胞的吞噬而沉积并引发肾小球肾炎和动脉炎。这些都对基于病毒粒子构建疫苗带来了许多的困难。

近些年DNA疫苗又成为一个新的研究热点，其原理是将编码引起免疫应答的目的基因片段插入质粒载体中，然后将重组质粒直接导入机体，它通过宿主细胞的转录系统表达目的抗原，进而诱导产生保护性免疫应答。它能同时诱导机体的体液免疫和细胞免疫，疫苗稳定，对保存温度要求不高，基因疫苗较之传统疫苗显示出了许多优点。

基于以上优点，有人尝试构建了NSl基因的DNA疫苗并检验了对ADV的保护作用。结果表明，将NSl的DNA疫苗与NSl蛋白疫苗配合同时免疫动物能起到部分保护作用［16］。基于以上原因，要想通过研制疫苗有效预防AD还有待时日。

［1］张振兴．经济动物疾病学［M］．北京:中国农业出版社，1994．

［2］殷震，刘景华．动物病毒学［M］．北京:科学出版社，1997．

［3］陈怀涛．动物疫病诊断病理学［M］．北京:中国农业出版社，1995．

［4］李通瑞，刘宏智，冯学平．动物检疫［M］．北京:农业出版社，1992．

［5］PORTER D D，LARSEN A E，COX N A，et al．Isolation of Aleutian disease virus of mink in cell culture［J］．Intervirology，1977，8(3):129－144．

［6］HAHN E C，RAMOS L，KENYON A J．Expression of Aleutian mink disease antigen in cell culture［J］．Infection and Immunity，1977，15(1):204－211．

［7］BLOOM M E，RACE R E，WOLFINBARGER J B．Characterization of Aleutian disease virus as a parvovirus［J］．J Virol，1980，5(3):836－843．

［8］BLOOM M E，ALEXANDERSEN S，PERRYMNA S，et al．Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus(ADV):sequence comparisons between a nonpathogentic and a pathogenic strain of ADV［J］．J Virol，1988，62(8):2 903－2 915．

［9］BLOOM M E，RACE R E，WOLFINBARGER J B．Identification of a nonvirion protein of Aleutian disease virus:mink with Aleutian disease have antibody to both virion and nonvirion proteins［J］．J Virol，1982，43(2):608－616．

［10］BRUMMERSTEDR E．Preparation of antigen for the counterimmunoelectrophoretic test for plasmacytosis in mink［J］．Acta Vet Scand，1976，17(4):395－402．

［11］常国权，杨盛华．水貂阿留申病的直接电镜和免疫电镜检查［J］．黑龙江畜牧兽医，1994(3):28．

［12］林学岷，刘静权，张翠兰．T淋巴细胞的酯酶标记在水貂临床上的应用探讨［J］．毛皮动物饲养，1990(2):4－7．

［13］AASTED B，LESLIE R G Q．Virus－specific B－lymphocytes are probably the primary targets for Aleutian disease virus［J］．Veterinary Immunology and Immunopathology，1991，28(2):127－141．

［14］徐磊．水貂阿留申病胶体金免疫层析诊断方法的初步建立［D］．北京:中国农业科学院，2010．

［15］朱善元，王健．水貂阿留申病基因检测芯片的研究与初步应用［J］．中国预防兽医学报，2006，28(6):688－691．

［16］YURDANA Castelruiz，MERETE Blixenkrone－Moller，BENT Aasted．DNA vaccination with the Aleutian mink disease virus NS1 gene confers partial protection against disease［J］．Vaccine，2005，23:1 225－1 231．