乙酰肝素酶与糖尿病性肾病的相关性研究进展

熊琪辉（综述），甘华侠（审校）

（南昌大学a.研究生院医学部2009级；b.第一附属医院内分泌科，南昌 330006）

糖尿病性肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者的重要死因，同时又是导致肾功能衰竭的一个重要疾病。早期诊断DN，有利于提高糖尿病患者的生存率、生活质量，减少国家的医疗负担。目前尚缺乏更优于尿微量白蛋白的检测指标，以更早的发现潜在的DN人群，早期对其进行干预，改变DN的发展及预后。

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）为广泛存在于脊椎动物和无脊椎生物组织细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）和细胞表面的生物大分子，并且是肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的主要构成成分。乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是一种葡萄糖醛酸内切酶，通过特异性降解释放出多种与HS结合的活性因子［碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子、白介素－2、肝素辅助因子Ⅱ等］，参与许多病理和生理过程。正常生理条件下，其基因表达和酶活性受到多种因素调控，否则其过度表达会促进诸多病理过程发生，如：肿瘤浸润转移、血管形成、炎症和自身免疫反应等。

笔者就近年来国内外关于HPA与DN之间相关性的研究进行综述，以求进一步明确二者之间可能存在的关联。

1 HPA概述

1.1 HPA的发现

M.Höök等［1］于1975年在鼠肝脏组织中发现一种降解HS侧链的内切糖苷酶，这是首次对于HPA存在的报道。但由于该酶的含量低、性质不稳定，并缺乏一种高效的检测方法，HPA蛋白的分离纯化研究遇到了重重困难。直到90年代后期，澳大利亚C.Freeman等［2］才成功建立了一个能够快速定量检测 HPA的方法。随后I.Vlodavsky等［3－4］的实验室又分别独立完成了HPA cDNA的基因克隆，推动了当今对HPA的进一步研究。

1.2 HPA的基因定位与结构

HPA基因的单核苷酸全长序列已经明确。该基因定位于4号染色体q21.3上，从起始密码子到终止密码子全长为40kb，含有12个外显子和11个内含子。启动子位于AUG上游2.3kb处，全长1 758bp，含有可编码543个氨基酸多肽的开放阅读框，相对分子质量为61 192，与从血小板中纯化的蛋白质分子质量相近。N末端有亲水侧链，17和35区有降解位点，110－170处有亲水基团，另外有6个N末端糖基位点。SDS－PAGE分析［5］证实纯化的HPA活性酶是由50kU亚基和8kU亚基非共价连接而成的异二聚体；有研究［6］证实，HPA前体酶必须经过蛋白酶解加工过程才可获得二聚体活性。

1.3 HPA的生物学功能及其调节

HPA为β葡萄糖苷酸内切酶，可以切断细胞表面和ECM中乙酰硫酸肝素盐蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）上的 HS，产生如下生物学效应：1）HSPGs水解，使ECM和GBM稳定结构破坏、细胞间质屏障功能降低；2）释放结合在HS上的bFGF，通过促进细胞分裂、趋化、微血管形成、胶原纤维降解等多方面作用，加快创面愈合及促进肿瘤的生长和转移，恢复凋亡细胞活力；3）释放结合在乙酰肝素上的尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）和组织纤溶酶原激活物（tPA），溶解基质网状结构；4）uPA和tPA还可通过活化表皮生长因子（epidermal growth factor，ECF），激活ECM中的蛋白质酶联反应，使膜的功能降低，屏障功能减退；5）诱发T细胞介导的迟发性超敏反应和自身免疫反应；6）激活酯酶增强脂质代谢。该酶广泛存在于细胞膜和ECM中，并保持稳定水平，以调节乙酰肝素生成和降解平衡，维持机体组织细胞正常的增殖、分化、黏附和迁移。

HPA的活性作用受神经生长因子（NGF）、乙酰肝素相关蛋白和富含组氨酸蛋白肝素类似物的影响。D.Marchetti等［7］在研究黑素瘤的神经营养调节、侵袭过程的实验中发现，NGF和神经营养因子23（NT23）能够提高HPA的活性，因为它们能够与神经营养因子受体p75NTR结合。然而不能与神经营养因子受体p75NTR结合的NGF突变体和非神经生长因子不能提高黑色素瘤细胞的侵袭力。另外还检测了在合成的HSPGs存在情况下RL95细胞HPA的活性，证实乙酰肝素盐相关蛋白和HPA对HS特异性识别有共同的机制，它们依赖HS的活性可能相互调节。

2 HPA与蛋白尿性肾小球疾病

肾小球滤过屏障是肾小球的重要结构，由内皮细胞、GBM、足细胞及其裂孔隔膜三层结构所构成，滤过屏障的完整性在阻止蛋白质漏出中起关键作用。HSPGs是一类大分子蛋白聚糖类化合物，由核心蛋白、HS侧链、葡胺聚糖侧链共价相连，是GBM的重要组成成分，HS侧链上硫酸根和羧基对GBM阴离子电荷起重要作用。HS一方面富含丰富的负电荷，可限制带负电的血浆白蛋白通过，另一方面可与GBM中的胶原和层粘连蛋白相互作用维持GBM分子结构的完整性。

一般认为，HPA是哺乳动物中唯一可以选择性降解HS侧链的糖苷内切酶，在脾脏、淋巴结等免疫组织中均可检测到，而在其他正常组织中，如肾脏、心脏等不表达或低表达。M.J.van den Hoven等［8］报道，HPA在人肾小球毛细血管内皮细胞表达极少，其中在皮质髓质的小管上皮细胞的表达相对较高。同时V.Levidiotis等［9］近来也报道HPA在正常大鼠肾脏的肾小球不表达，在小管上皮细胞呈低表达。但是病理状态下肾脏HPA的表达增高（主要是肾小球HPA的表达增加），从侧面证明了机体内正常水平HPA含量对于维持肾小球正常生理功能的重要性。

HPA通过裂解HS侧链，破坏HSPGs完整性可导致GBM选择通透性改变及肾小球上皮细胞和内皮细胞锚连位点的丧失。此外，HPA不仅能够降解HS侧链，还使与HS结合的一系列生长因子释放出来，产生相应的继发反应可能参与了在各种蛋白尿性肾小球疾病（糖尿病性肾病［10－11］、动物模型的膜性肾病［12］、药物所致肾病［9，13］、抗基底膜抗体疾病［14］、儿童激素敏感性肾病综合征［15］、局灶节段性肾小球硬化性肾病、IgA肾病、微小病变性肾病［16］、淀粉样变性病［17］）的病理生理过程。

但存在争议的是，最近有一部分研究显示HPA可能与肾小球性蛋白尿的发生发展并不存在明确的关联。T.J.Wijnhoven等［18］研究表明，不论伴有或不伴有蛋白尿的成年人和儿童肾脏病患者的肾脏HS主链表达没有异常。J.van den Bom等［19］研究表明，尿白蛋白排泄率增加可能与肾小球HS的表达和结构的改变没有明确的关联。更有研究［20］提出新的观点，认为HS保持GBM处于一个“开放状态”，促进蛋白通过肾小球毛细血管壁。研究人员给小鼠静脉应用神经氨酸苷酶（可水解GBM神经氨酸）后导致小鼠产生白蛋白尿，再加用肝素酶Ⅲ后，电镜下发现HS消失，同时尿中蛋白减少。

3 HPA与DN的相关性

我国DN是导致终末期肾病的第二位原因。DN导致蛋白尿形成的机制有：肾小球内毛细血管跨膜压力过高；肾小球滤过屏障功能障碍，包括滤孔改变和电荷改变；肾小球上皮细胞代谢障碍等。近年来，人们对DN分子发病机制的认识不断深入，血流动力学紊乱/内皮细胞受损固然是DN蛋白尿的始发因素，但内皮细胞之间的窗孔较大，在正常情况下即能让白蛋白自由通过，GBM则成为真正防止蛋白质漏出的第一道屏障。

近年来有许多的证据表明，HPA参与了DN的发生发展。J.B.Maxhimer等［11］研究表明，在DN的病理状态下，可能由于内环境中高水平葡萄糖含量的影响可诱导HPA的表达增加和基底膜上HS的表达减少。在体外高糖环境中培养肾脏上皮细胞发现HPA mRNA的表达上调，HPA抑制剂能够保护细胞表面HS的表达。又有进一步的研究［10，21］观察到，在临床蛋白尿和微量白蛋白尿的糖尿病患者中HPA的活性是增加的，相对正常人的尿液中未能检测到HPA的活性。唐琳等［22］进行的研究表明，DN患者肾组织中HPA表达升高，并且与尿蛋白量呈正相关，提示HPA可能参与了DN蛋白尿的发生。

有研究［23］测定证实糖尿病患者血液、尿液中HPA的水平是增高的。DN患者比不并存糖尿病并发症者血液、尿液中HPA水平增高更加明显，DH患者中的血HPA水平的增高，会进一步导致整个机体中HPA水平的升高，从而影响到其他的器官、组织和细胞。而接受肾移植后的DN患者尿液中HPA的水平降低，说明了HPA可能主要来源于糖尿病相关的肾功能衰竭。事实上，免疫组织化学研究分析表明，HPA表达于肾小管上皮细胞，在正常肾脏的肾小球中不表达；但是在DN的肾小球和肾小管上皮细胞其表达上调［11］。值得注意的是，在糖尿病肾移植患者，除了糖尿病相关的药物，还需要应用的免疫抑制药物可能会影响乙酰肝素酶的分泌。

4 结语

DN是糖尿病的重要并发症，是一种蛋白尿性肾小球疾病，HPA可通过水解肾小球GBM的重要组成成分HSPGs，导致GBM电荷屏障破坏而在蛋白尿的发生、发展中起到一定作用。多项研究证明，DN患者机体中HPA水平的变化参与了DN的病理生理过程。能否通过检测HPA早期诊断DN，及通过抑制HPA的表达是否有助于防治DN的发生发展有待于进一步的研究。

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