热休克蛋白70与心肌细胞的凋亡

童金英(综述），朱清仙(审校）

（南昌大学a.研究生院医学部2008级；b.基础医学院，南昌 330006）

1962年F.M.Ritossa将果蝇的培养温度提高后，发现了热休克反应，1974年A.Tissieres等[1]进一步研究分离出热休克蛋白 （heat shock protein,HSP）。HSP是机体除热应激外，在寒冷、缺血、机械刺激、有毒化合物等应激条件下迅速合成的一组蛋白质，也称热应激蛋白。HSP家族被分为：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小分子 HSP，其中 HSP70是研究较多的蛋白质之一［2］。近年来国内外学者一直在探索HSP70的特性及其在心脏疾病治疗中的作用,HSP70在心肌细胞中的抗凋亡作用和心肌保护作用逐渐被人们所认识[3]。本研究对热休克蛋白及其对各种应激条件下心肌损伤的保护作用及机制进行综述。

1 HSP70的分类、结构及生物学特性

1.1 HSP70的家族成员

HSP70的家族成员最多，共有21种蛋白质[4]，大致分为以下 4 类：1）HSP（70），也称为 HSP72，其主要存在于胞浆中，胞核通常在正常情况下并不表达或表达量很少，但在热应激或其他应激作用下迅速增加表达，属于诱导型HSP70；2）热激同源蛋白70（heat shock cognate 70），也称为 HSP73，在所有细胞的胞浆和胞核中均有所表达，为结构型HSP70，与HSP70具有高度的序列同源性（95%）和相似的生物化学特性；3）葡萄糖调节蛋白 78（glucose regulated protein78,GRP78），存在于内质网胞内；4）GRP75，位于线粒体内。

1.2 HSP70的功能结构

HSP70是一组在进化上高度保守的应激蛋白[4]，具有3个功能域：1）近N端是高度保守的序列，又称核苷结合域（nudeotide biding dowain,NBD），由 4个结构亚区组成，结合并水解ATP；2）紧接着是多肽结合域（peptide biding domain,PBD）,属相对保守序列，包含2个结构亚区，形成多肽结合袋状结构，可与底物相结合，识别靶多肽并与之结合调节其合成的作用；3）近C端是结构多变序列，与特定的蛋白底物结合有关。

1.3 HSP70的生物学特性

目前HSP70被认为是哺乳动物细胞HSP中最重要的，这与它所具有的以下生物学特性密切相关：1）生物界的普遍性。从原核生物到真核生物都有HSP70的表达，同一种生物体内的不同组织内均有表达。2）高度的保守性。不同生物来源的HSP70氨基酸序列有50%～90%同源性。3）正常情况下HSP70在细胞内表达水平较低，而在热应激或其他应激作用下迅速增加HSP70合成，以提高抗应激能力。4）正常情况下HSP70位于细胞浆，当细胞遭受应激作用时，HSP70迅速移入细胞核内并包围核仁，胞浆内只有少量表达，而应激消除后细胞处于恢复阶段时，细胞核内的HSP70又返回胞浆，在细胞浆内呈低水平表达，再次应激又重新返回细胞核。5）HSP70家族成员均具有与核苷酸特别是与ATP或ADP结合的特性。

2 细胞凋亡

细胞凋亡是指细胞在一定的应激条件下发生的自主有序的死亡。许多信号刺激可以诱导细胞发生凋亡,如紫外线照射和电离辐射、抗癌药物、生长因子缺乏、过度表达某些特定的癌基因等。尽管这些信号以及随后的反应途径多种多样,但现已公认,细胞凋亡后期的共同途径是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases）的激活[5]。激活的Caspases可以水解包括细胞调节、细胞信号转导、DNA修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现为凋亡特有的形态学及生物化学特征。

线粒体在细胞凋亡中起着决定性的作用。线粒体在细胞凋亡过程中最重要的一点在于它可释放能够激活Caspases的蛋白。从线粒体释放的细胞色素C与ApaH、Procaspase 9结合在一起形成凋亡体(Apoptosome)，并使caspase-9激活。除细胞色素C之外,线粒体还可释放其他介导细胞凋亡的分子:Procaspase-3和凋亡诱导因子AIF(Apoptosis-inducing factor)。

3 HSP70与细胞凋亡

S.A.Gordon等[6]实验发现，热休克预处理产生的抗凋亡作用是由HSP70介导的，并能抑制多种刺激诱导的细胞凋亡。有研究[7]证明：HSP70可以通过以下途径对细胞凋亡过程进行阻断。

3.1 稳定细胞内变性的蛋白质

在应激情况下，变性蛋白失去正常的三维结构，暴露出隐藏在内部有着与HSP70高度亲和性的疏水性位点，HSP70作为主要的分子伴侣蛋白，与这些应激过程错误折叠或聚集的蛋白质结合，降低产生不溶性聚集物的危险性，加速受损伤蛋白质的再折叠，对应激细胞具有早期保护作用[8]。

3.2 阻止细胞色素c/caspase-9/Apaf-1凋亡体形成

从线粒体释放的细胞色素C能与凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor 1,A-paf-1)和caspase-9形成凋亡体，诱导细胞凋亡。研究[9]发现，表达HSP70能抑制Caspase-3的活性，起到抗凋亡的作用。HSP70还能与肿瘤抑制蛋白PHAPI、凋亡易感蛋白CAS共同作用，加速Apaf-1的核苷交换，阻止无活性的Apaf-1/细胞色素C聚合，从而加速凋亡体的形成。

3.3 阻止凋亡诱导因子AIF从线粒体释放及入核

AIF是位于线粒体内膜的黄素蛋白，在凋亡信号刺激时，AFI分子从线粒体释放到胞浆，再通过其核定位信号转位到细胞核中，直接引起染色体聚集、核呈大片段断裂，导致细胞凋亡，这个过程是caspase非依赖的。研究发现AIF的150-228位氨基酸残基与HSP70结合后，不能入核促使DNA片段化引起细胞凋亡，通过HSP70其ATP酶结构域和EEVD伴侣基序与AIF结合，并将从线粒体泄漏的AIF扣押在细胞质中，避免细胞凋亡[10]。

3.4 抑制应激活化蛋白激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK)

活化蛋白激酶JNK是细胞凋亡信号传导过程中关键性的应激激酶。在多种应激的情况下，活化的JNK可以通过磷酸化p53和Myc蛋白，或通过磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X促进细胞色素c自线粒体释放，从而诱导细胞凋亡。而同样获得增强的HSP70通过阻断信号通路，抑制应激诱导的SAPK/JNKs激活，阻断JNK介导的细胞凋亡[11]；HSP70对JNK的活化抑制机制可能与清除异常蛋白在细胞内的积聚有关，与诱导型 HSP70的蛋白保护或再折叠作用机制不相关。

3.5 抑制凋亡基因P53、Bax的表达

有研究[6]发现，上调HSP70表达能抑制P53和P53介导的细胞凋亡，并明显减少Bax表达的上调，而对Bcl-2的表达无影响，HSP70可能通过抑制P53而防止P53介导的Bax基因的转录激活，但是，HSP70、P53和Bax之间的关系不完全清楚，还需要进一步研究。

4 HSP70与抑凋亡蛋白Bcl-2家族的关系

细胞凋亡区别于细胞坏死的一个显著特征即受基因调控，Bcl-2基因是目前较为公认的与凋亡密切相关的基因家族。已在哺乳动物发现的Bcl-2基因蛋白家族由抑制凋亡的相关蛋白A1、Bcl-2、Bcl-X1、Mcl-1 等，及促进凋亡蛋白 Bak、Bax、Bid、Bik、BNIP3等组成。Bcl-2蛋白是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因[12]。Bcl-2蛋白调节细胞凋亡的机制是多种途径的共同作用：1）Bcl-2和Bax的比例调节凋亡发生，Bcl-2和Bax既可以形成同源二聚体形式诱导凋亡，也可以形成异源二聚体“中和”凋亡[13]；2）定位于内质网膜的 Bcl-2，通过阻断 Ca2+从内质网向胞质中的流动，降低核酸内切酶活性，从而阻断细胞凋亡；3）Bcl-2抑制氧自由基的产生而发挥其抑制细胞凋亡的功能；4）对线粒体功能的保护作用:Bc1-2、Bc1-xl插入线粒体外膜，通过形成离子通道，帮助H+转运出线粒体，从而维持线粒体完整性。Bax促进线粒体通透性转换孔（PTP）开放，导致线粒体结构和功能的紊乱，释放出caspase-9，诱导细胞凋亡[14]。

HSP70与Bcl-2有一些相似之处，如二者均在线粒体上有表达、均有抗氧化损伤作用、对一些凋亡因子引起的细胞凋亡均有抑制作用、对caspase-3有抑制作用等。经线粒体通路介导的凋亡信号其重要的特征是凋亡体的形成，HSP70可以通过阻断细胞色素C的释放，阻断Apaf-1寡聚化及阻断caspase-9的活化等多重环节阻断凋亡体的形成[15]，对线粒体通路介导凋亡体形成的不同阶段发挥阻断作用。而且，在某些细胞凋亡中，二者有协同作用。

有研究表明，热耐受既能诱导Bcl-2表达，也能诱导HSP70的表达；HSP70的过量表达也不会影响Bcl-2的表达。尽管HSP70与Bcl-2的抗凋亡作用机制是否相同、二者关系如何，目前尚不清楚，但它的抗凋亡作用在许多方面得到了证实[16]。

5 HSP70抗心肌凋亡作用的研究现状

近年来关于心肌保护的研究多注重于调动心脏内源性的保护机制，以提高心肌细胞自身耐受缺氧的能力。而HSP70已被证实是机体应激状态下产生的一种重要的内源性保护因子。

心肌缺血再灌注可导致细胞的坏死和凋亡[17]，细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发病机制的重要环节之一。最近,A.Laubriet等[18]发现，HSP70和p53均在心肌缺血再灌注损伤过程中有明显变化，而后者又是重要的细胞凋亡调控基因,HSP70与细胞凋亡的相关性很可能是通过 p53为中介的。H.Fliss等[19]采用原位末端标记法和琼脂糖凝胶电泳发现缺血及灌注期均可发生凋亡，但与缺血及灌注时相有关。F.Nomura等[20]发现，经热休克预处理24 h后的绵羊在心肌缺血再灌注后,心室功能、内皮功能及有氧代谢的恢复明显优于对照组,诱导型HSP在热休克15 min后即出现,并持续到24 h后，提示HSP在心肌缺血后的自我保护作用中起着重要作用 。王乔等[21]用结扎左冠状动脉前隆支法建立大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型，用免疫组织化学方法检测HSP70表达，用TUNEL技术检测心肌细胞凋亡。结果显示，在急性心肌缺血再灌注损伤过程中，HSP70和细胞凋亡均呈现明显地动态性表达并有着明显的相关性；HSP70的代偿性增加可能抑制细胞凋亡的发生；细胞凋亡的发生可能是诱发HSP70表达的一个重要机制。

随着分子生物学技术的不断发展，人们更加深入地研究了HSP70在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用。J.Jayakumar等[22]研究证明，采用 HSP70转染的方法可以加强对心脏机械和内皮功能的保护；HSP70表达的代偿性增加可能抑制心肌细胞凋亡从而成为心肌保护的一种理论依据。这与K.Suzuki等[23]的发现大体一致。K.Suzuki等[23]通过大鼠冠状动脉内灌注日本脂质体血凝病毒基因转染和在体外通过缺氧复氧诱导HSP70的过度表达，结果显示：试验组心脏自主复跳的时间、血清肌酸磷酸激酶水平、缺口末端标记法中心肌细胞阳性染色的百分率明显少于对照组，通过流式细胞仪检测凋亡细胞DNA片段，试验组明显少于对照组，充分说明了 HSP70的过度表达减少了心肌细胞凋亡，发挥了对心肌细胞的保护作用。

J.Jayakumar等[22]通过转染HSP70基因到大鼠心脏后发现,转基因大鼠心脏缺血再灌注后心功能恢复明显优于对照组，肌酸磷酸激酶漏出减少。提示HSP70的过度表达可能在心肌损伤中起着保护作用,HSP70基因转染可通过增强自我保护作用而成为心肌保护的一种独特的方式。

更多应激条件下的心肌凋亡蛋白的表达与HSP70表达的研究开始实施。池一凡等[24]建立langendorff离体心脏灌注模型，实验组腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素，然后运用免疫组化测定心肌HSP 70、Bcl-2、Bax蛋白的含量，结果发现：实验组 HSP70含量较对对照组明显升高，Bcl-2的表达较对照组明显增多，Bax的表达较对照组明显减少，从而得出心肌HSP70高表达能促进心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减少促凋亡蛋白Bax表达，增加Bcl-2/Bax概率，抑制心肌细胞凋亡。张伟华等[25]研究报道，利用体外培养大鼠、乳鼠心肌细胞同时温度诱导细胞产生HSP70，H2O2造成心肌损伤，发现温度诱导后HSP70在胞浆中大量表达，保护组凋亡率显著低于损伤组，Bcl-2和Caspase-3在损伤组大量表达，提示HSP70可延迟细胞凋亡，对心肌细胞具有保护作用。

S.Okubo等[26]将单纯载体、腺病毒·LacZ基因(Ad·LacZ)、腺病毒·HSP70(Ad·HSP70)基因分别转移入兔的心肌中，然后经过30 min缺血和3 h再灌注 ,发现 Ad·HSP70组的心肌梗死面积减少,而且这种保护作用仅表现在注射部位,在非注射部位没有明显的保护作用。充分说明了通过体内兔心肌HSP70基因转移减少了 I/R心肌的梗死面积，HSP70的代偿性增加是心肌损伤的一种重要自我保护作用。

总之，细胞凋亡不仅仅是心肌损伤的标志,可能也是通过加强某些应激蛋白的表达及其他途径而产生对心肌的保护作用。作为分子伴侣的HSP70，它的表达不仅仅是心肌缺血再灌注损伤的标志，也起到通过抗氧化和抗凋亡等机制加强对心肌多方面的保护作用，这为临床上寻求新的心肌保护途径以及基因工程和药物的治疗开发提供了重要的理论依据。但具体的调控机制及如何利用该作用进行细胞保护，有待于深入研究。

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