细胞悬浮培养制备紫杉醇的研究进展

王巍杰*，杨永强，吴尚卓

（河北理工大学 化工与生物技术学院，河北 唐山063009）

0 引 言

红豆杉是红豆杉科、红豆杉属植物的总称，为耐荫树种，多散生于阴坡或半阴坡的针阔混交林下。抗寒性强，可耐-30℃以下的低温，最适生长温度为20～25℃。分布在北半球温带和亚热带，全球共有11种，我国分布有五种，包括一变种。美国化学家Wani等[1]在1971年首次从短叶红豆杉树皮中提取出具有抗癌药效的紫杉醇，使其药用价值备受关注。

紫杉醇（pacilitaxel，商品名 taxol）是一种四环二帖化合物，因其高效的抗癌活性成为研究的热点，研究结果[2-5]显示紫杉醇能有效治疗肺癌、卵巢癌和乳腺癌等多种癌症。其抗癌机理主要通过附着到肿瘤细胞的微管上，诱导和促进微管蛋白聚合形成稳定结构，抑制微管的解聚，细胞大多停滞在细胞分裂的 G1期和M期直至死亡，阻止了癌细胞的分裂和扩散[6-8]。紫杉醇临床需求量大，单纯从红豆杉中提取远不能满足市场需求，研究者们开始采取其他途径获取紫杉醇，目前正在研究的方法有人工种植红豆杉、化学合成、生物合成、微生物发酵和细胞悬浮培养五种方法。化学合成过于复杂，人工种植周期长，相较其他方法，细胞悬浮培养原料丰富，大规模反应较易实现，更具应用价值。

1 生物合成途径

紫杉醇的生物合成是利用植物体内易得的前体物质经连续的酶促反应合成紫杉醇的方法，包括母环和侧链的单独合成及两者的结合。原理是利用异戊二烯合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸，环化形成紫杉-二烯母环骨架，经过对C1和C2等的修饰形成紫杉醇的直接前体巴卡亭III，其中紫杉-二烯母环骨架的生成是第一个关键步骤[9]。Hezari M和Croteau R[10]系统研究了母环的形成，并提出生物合成的全过程可在无细胞酶水平上解释。紫杉醇的侧链由α苯丙氨酸经β苯丙氨酸C2位的羟基化和N原子的酰基化作用而形成，侧链沿一定顺序连接到巴卡亭IIIC13氧原子上生成紫杉醇。

生物合成主要依赖酶的催化活性，Steele CL等[11]利用细胞培养技术分离出在紫杉醇C-13侧链合成中起关键作用的苯丙氨酸变位酶PAM，并获得了PAM的cDNA克隆，在大肠杆菌中的基因表达证明了酶的活性。紫杉醇生物合成中所有羟基化反应均由细胞色素P450单加氧酶及其类似酶催化[12]，Jennewein S等[13]成功构建了属于细胞色素P450单加氧酶的紫杉二烯-5α-羟化酶的cDNA，并通过酵母细胞和昆虫细胞的表达证明其具有编码酶的活性。目前提出了紫杉醇生物合成的一些假设途径，但许多关键酶基因尚未被克隆，它的应用还需基因工程、分子生物学等学科发展的带动。

2 微生物发酵途径

一些微生物在代谢过程中会产生次级代谢产物紫杉醇，利用微生物发酵是获得紫杉醇的另一途径。1993年，Stierle A等[14]分离出一种内生真菌(Taxomyces andreanae)，发现这种内生真菌在半合成液体培养基中生长时会产生紫杉醇及其类似物，由此引发了利用微生物发酵产紫杉醇的研究热潮。Zhao 等分离鉴定了一种产紫杉醇真菌，它形态与黑曲霉相似，但二者分生孢子的形状和大小有所不同，归类为黑曲霉的一种突变株，其耐受温度为43℃[15]。最近，M iao Z等[16]首次发现一种能产紫杉醇的毛霉菌DA10，利用色谱分析和光谱法检测到对肝癌治疗活性。

红豆杉的枝条、树叶等均可用于真菌的分离[17]，但产紫杉醇的真菌多是红豆杉内生菌，菌丝不发达，在自然界中很难筛选出高产紫杉醇的菌株，目前利用真菌发酵生产的紫杉醇产量仅为每升几百微克，尚未形成工业化生产规模。

3 细胞悬浮培养

细胞悬浮培养是利用红豆杉等植物不同部位作为外植体，以培养细胞的方式生产紫杉醇的方法。它可以通过生物反应器大规模培养细胞获得代谢产物，且愈伤组织的来源非常丰富，不会对红豆杉的生存造成威胁，是理想的紫杉醇获得途径[18]。其中外植体、培养基组分和诱导因子是影响紫杉醇产率的主要因素。

3.1 外植体的选取

外植体的来源广泛，植物的根、茎、叶均可用作为愈伤组织的来源，但紫杉醇产率有所不同。早在1992年，Fett-Neto AG等[19]就研究了不同外植体对紫杉醇产量的影响，采用绿色和红色的假种皮以及胚、幼茎和针叶作为愈伤组织的诱导。培养两个月后利用高效液相色谱HPLC法分离紫杉醇，光电二极管阵列光谱测定其吸收峰显示，紫杉醇占干重量的0.02±0.005%，并发现红豆杉外植体的生长受植物生长调节剂2,4-D和激动素浓度影响。来源于不同种紫杉的同种组织合成的次级代谢产物产率也有所不同，通过较大规模的培养优选后可得到140-295mg/L紫杉醇的产量[20]。

红豆杉生长缓慢，将其作为外植体的唯一来源会对树种的生存造成威胁，为保护这种宝贵的自然资源，Bestoso F等[21]考察从其他种属植物的细胞培养中提取紫杉醇的可能性，他们将欧洲榛中的茎、树叶和胚作为外植体，用不同的激素进行诱导，发现最适合进行悬浮细胞培养的是胚，紫杉醇的产率相对于红豆杉细胞培养无显著差异，并且产量可通过添加激素提高。欧洲榛树分布广泛，外植体来源充足，且细胞培养周期比红豆杉短，能最大限度减少培养期间的污染，有望作为红豆杉的替代物。

3.2 培养基组分

细胞悬浮培养涉及到诱导愈伤组织和培养分散细胞系两类培养基的选取。在愈伤组织诱导阶段，用含3.0mg/LNAA、0.5mg/L的激动素、100mg/L精氨酸、2.5%蔗糖和0.8%琼脂的MS的培养基培养两个月，可得到胚外植体86.4%的诱导率，树枝诱导率达到100%。进一步研究表明，当FeSO4浓度从27.8mg/L增加到55.6mg/L可显著提高愈伤组织的诱导率，并且在MS培养基上培养一定时间后再转移到B5培养基可加快愈伤组织的生长速度[22]。如果单用B5培养基培养，最适培养基组分为 1%的蔗糖、0.2%的酪蛋白氨基酸和1mg/L的2,4-D[23]。

外植体经处理成为细胞团后移至培养基悬浮生长，最优的培养基组分既要适宜细胞正常生长，更要使紫杉醇的产率达到最高。研究发现，改变培养基中蔗糖、赤霉素的浓度和2,4-D与激动素的比值可以提高紫杉醇的产量[24]。Khosroushahi等[25]分两阶段培养悬浮细胞，在刚得到细胞系后的第一阶段，向B5培养基补充硫酸氧钒，硝酸银和氯化钴盐使细胞获得最大生长速率，10天后补充1%的蔗糖和50mg/l的柠檬酸铵，第20天补充0.1mM的苯丙氨酸。培养25天后达到第二阶段，再加入不同浓度的诱导剂能显著提高紫杉醇产量。此外，Zhong等[26-31]已考察了从摇瓶培养过渡到较大规模生物反应器反应过程中，氧气、二氧化碳、pH值等对产率的影响，对于紫杉醇大规模生产的研究具有指导意义。

3.3 诱导因子影响

诱导因子是指能促进或抑制生化反应影响代谢产物合成的物质。细胞培养中诱导因子对组织细胞的生长起着重要作用，Zhang等[32]研究了乙烯含量对紫杉醇产量的影响，在细胞悬浮培养前或培养中加入乙烯合成抑制剂α-异丁酸、CoCl2和NiCl2，乙烯活性抑制剂Ag+，发现都能提高紫杉醇的产率，当20 μM CoCl2和30 μM Ag+联合应用时可将紫杉醇产率提高三倍。相反，当加入乙酰水杨酸和茉莉酸等乙烯合成促进剂后，紫杉醇的产率明显降低，说明在细胞培养中乙烯的含量是影响紫杉醇产量的重要因素，因此可通过加入乙烯抑制剂能增加产率。Rosa M等[33]在B5固体培养基上加入0.05或0.1mM的VSO4，培养欧洲红豆杉愈伤组织两个月后发现，细胞的生长速率和紫杉醇、浆果赤霉素III的产率都有所提高，VSO4的促进作用在细胞培养后期更为显著。而Tabata H[34]发现茉莉酸甲酯可显著提高紫杉醇的产量，并优化了愈伤组织的培养条件，研究结果显示茉莉酸甲酯提高产率的原因是影响紫杉醇合成过程中骨架的形成。当茉莉酸甲酯与另一种诱导因子几丁七糖共同作用时更能提高紫杉醇产量[35]，而胶体几丁质和几丁质寡糖的加入又可增强茉莉酸甲酯对紫杉醇生成的诱导作用[36]。

3.4 产物的分离与纯化

细胞培养后先将水溶性培养液滤过和离心除去细胞碎屑等杂质，可利用尼龙纤维薄膜截留紫杉醇，用合适的溶剂迅速精提紫杉醇。紫杉醇产物的分离常用甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醚等作为溶剂。分离效果较好的有高效液相色谱法、氧化铝柱层析法和树脂柱层析法[37]。Sun等[38]利用廉价高效的大孔树脂柱层析分离出紫杉醇及其类似物，对比发现，AB-8树脂具有最好的吸附和解吸能力，选取不同的解吸参数分离出10-去乙酰巴卡亭III 、7-木糖苷-10-去乙酰紫杉醇、三尖杉和紫杉醇。Zhang等[39]采用正相氧化铝柱层析和反相C18柱层析从红豆杉培养细胞浸提物中分离纯化了紫杉醇，发现用氧化铝柱层析后可使紫杉醇分离量增加，重结晶后可得纯度超过98%的紫杉醇晶体。此外，利用海藻酸钙凝胶固定细胞培养液已成为可能，固定化细胞培养具有产物分离彻底、简便等优点，有望广泛用于紫杉醇产物的分离[40-41]。

由于紫杉醇与其类似物结构相似，产物间的分离纯化很难获得理想结果。Fu等[42]为分离10-去乙酰巴卡亭III 和7-木糖苷-10-去乙酰紫杉醇，选取AB-8型树脂进行动态吸附和吸附实验，使二者成功分离，获得了较高的分离度。紫杉醇和三尖杉宁碱的结构非常相似，只是 C-13侧链末端不同，二者不易分离，Kingston DG[43]采用四氧化锇作为化学修饰剂，发现四氧化锇可选择性地氧化三尖杉宁碱侧链末端的双键形成二元醇，利用层析法将二者分离。若在紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物中加入溴等卤素，利用与三尖杉宁碱不饱和侧链间的卤化反应也可分离出紫杉醇[44]。

4 展 望

随着对助溶剂的研究，紫杉醇水溶性差的问题将被解决，其应用也将更加广泛，由此药源短缺的问题会日益凸显。化学合成过于复杂，中间产物的镜像对映体使合成存在较大的不稳定性；人工种植红豆杉的培养周期过长，大面积的红豆杉人工林短期内还无法形成；生物合成和微生物发酵的商业化还需要基因工程、分子生物学的发展来带动，在现阶段很难有所突破。相比之下，细胞悬浮培养是当前最具优势的紫杉醇获得途径。大规模的细胞培养已经成为可能，对培养基组分的进一步优化，可有效调控细胞的代谢途径，获得大量的紫杉醇及其类似物，高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱[45]等改良纯化技术的应用，可快速、高效地分离提纯紫杉醇。相信随着研究的深入，细胞悬浮培养途径可在保护珍贵红豆杉资源的前提下，满足市场需要，解决紫杉醇药源短缺的问题。

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