槐角中黄酮化合物的提取分离研究

申艳艳,汪海峰,张妮萍,许茜

(1.东南大学公共卫生学院,江苏南京 210009;2.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏南京 210003)

中药槐角为豆科植物槐(Sophora japonica L)的干燥成熟果实,传统医学认为槐角具有清热泻火、凉血止血的功效,为《中华人民共和国药典》历版所收录。槐角中已知结构的黄酮化合物已有30余种,具有很高的药用价值,在食品、化妆品等行业中广泛应用。随着市场需求量的增加、经济效益的提高,从天然产物槐角中提取分离黄酮类化合物已日益引起重视。为促进对槐角中黄酮化合物研究与开发,现对槐角黄酮化合物提取和分离方法的研究进展进行综述,以期对其开发利用提供参考依据。

1 槐角中黄酮类化合物的提取

1.1 按提取溶剂不同分类

天然黄酮类化合物多以苷类形式存在,并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接形式不同,可以组成各种各样的苷类。黄酮苷由于羟基的引入,将增加在水中的溶解度。少量黄酮化合物以苷元形式存在,难溶或不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂中。因此,选用不同的溶剂提取得到的产物略有不同,产率也稍有差异。

1.1.1 水溶剂提取 黄酮苷类物质在水中的溶解性较好,通常可以采用水溶剂提取,在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素。冉晓燕等[1]利用水溶液浸提方法将槐角中总黄酮提取出来。最佳提取条件是:槐角与料液(水)比例为1∶8,温度为90℃下浸提2次,每次2 h。冯爱青等[2]以豫西山区的槐豆为原料,研究热水提冷析出法提取芦丁的最佳工艺条件:在粉碎槐豆中加入8倍量的水浸提30 min,抽滤,再加入5倍量的水浸提20 min后抽滤,滤液静置10 h,析出沉淀,过滤,干燥得到粗芦丁,将粗芦丁用甲醇进一步浸提得到纯度高达48%的精制芦丁。该工艺提取率达18%,高于传统的碱提酸沉法2倍。

该方法成本低、安全,适合于工业化大生产。但收率很低,并且由于水的极性大,易把蛋白质、糖类、无机盐等易溶于水的成分提取出来,因此易霉变,一般提取液存放10 d左右就会有发霉、变质现象,提取液过滤、浓缩等操作困难且费时,固体黄酮含量低。

1.1.2 有机溶剂提取 目前国内外广泛使用有机溶剂提取法得到目标物质,乙醇和甲醇是提取黄酮类化合物的最常用溶剂。高浓度的醇(90%～95%)适合提取苷元,60%左右的醇适合提取苷类,提取的次数一般为2～4次。王景华等[3]分别选取水、丙酮、乙醇等溶剂提取槐角中的总黄酮,只有乙醇提取可以得到较好的得率(63.27%)和黄酮含量(6.84%);采用正交试验对有机溶剂浓度及用量、提取时间和提取次数优化提取方案。虽然有机溶剂可较好地实现对黄酮化合物的提取,但是有机溶剂有毒,会危害人体和污染环境,为后续的处理带来困难。

1.2 按提取方法不同分类

1.2.1 回流提取法 回流提取法是黄酮化合物提取最常用的方法,所用回流剂通常为水、醇及混合溶剂。此法操作简便,但效率不够高,很难一次性完全提取出黄酮化合物。采用索氏提取器便可使得回流剂反复使用,价格低廉且效率高。该法目前已被广泛用于黄酮化合物的提取,但提取时间较长。

1.2.2 超声波提取 田中民等[4]比较了超声波提取法和回流法对槐角中的异黄酮类成分的提取效果,结果表明超声波提取法相对回流法可使槐角中的槐角苷在更短的时间内溶出。这是由于超声波具有特殊的生物效应,利用其空化作用,选择适当的超声参数可以使植物细胞壁间形成较多的小孔,加速细胞内物质的释放和溶解以及有效成分的浸出,大大提高了提取效率。同时发现超声波功率和超声持续时间对槐角苷的提取率具有显著性的影响(P＜0.01),而脉冲宽度和间歇时间对槐角苷的提取率影响不显著(P＞0.05)。因此,在实际的生产中有必要考察不同功率在不同时间对提取率的影响。

超声提取法具有提取时间短、效率高、无需加热等优点。但超声波提取对容器壁的厚薄及容器放置要求较高,否则会影响药材的浸出效果,目前仍处于小规模实验阶段,要用于大规模生产尚需进一步解决有关工程设备的问题。

1.2.3 微波提取法 微波协同植物有效成分的提取是一种较新的提取技术,与常规的提取技术相比较,具有高效率、易控制、穿透力强、选择性高、提取成本低等特点。刘寿林[5]以槐角为原料,甲醇为溶剂,利用微波辐射、回流提取染料木素,考察了微波功率和辐照时间对染料木素的提取率和纯度的影响。与传统的提取工艺对比,提取时间由120 min缩短为40 min,有效成分的提取率提高了3.6%,同时微波制热还有利于槐角中含量较高的染料木素的苷类向苷元转化。

1.2.4 亚临界水提取法 亚临界水也被称为过热水、高温水、高压热水或热液态水,是指在一定压力下,将水加热到100℃以上临界温度374℃以下的高温,水体仍然保持在液体状态(或指压力和温度在其临界值之下的附近区域的液态水)。通过对亚临界水温度和压力的控制可以改变水的极性、表面张力和黏度。随着温度的升高水的极性会降低,对有机物的溶解能力会增加。常温下纯水的介电常数约为80,而升温、升压至250℃、5 MPa时水的介电常数降低到27[6],这个值和25℃、0.1 MPa下的乙醇相同,因此极性足够低,可以溶解许多中等和低极性化合物。丛艳波等[7]通过单因素和正交试验,以染料木苷为对照、总异黄酮的得率为指标,优选出槐角异黄酮的提取工艺参数。

将亚临界水提取用于槐角黄酮的提取上,是从槐角中提取黄酮的一种新的探索,这不仅可以避免有机溶剂对黄酮的污染,而且成本低,这对槐角异黄酮的生产利用具有十分重要的意义。

1.2.5 双水相萃取 双水相萃取技术是针对生物活性物质提取而开发的一种新型液-液萃取分离技术,与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的作用以及溶液环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同,即各成分在两相间选择性分配,从而达到萃取的目的。与传统的萃取技术相比,双水相萃取不会引起生物活性物质的失活,易于工艺放大和连续操作。

作为一种新型的分离技术,在黄酮化合物的提取方面已有较广泛的应用[8-9]。Zhang等[10]取一定量的银杏叶浸提液,25℃加到PEG/磷酸盐体系双水相系统中,相比为0.56,则黄酮类化合物进入上相PEG,从而将黄酮化合物富集分离,提取率可达98.2%。除了常用的PEG/无机盐体系,目前还出现了有机溶剂(丙酮、乙醇)/无机盐体系、离子液体系。尽管双水相体系具有分相快、使用温度低和易于操作等特点,然而依然存在水溶性高聚物大多数黏度较大、不易定量控制等问题。该方法为槐角中黄酮类化合物提取探索了一条途径,但在具体应用时仍需作进一步的改善。

2 槐角中黄酮化合物的分离纯化

2.1 高速逆流色谱分离法

高速逆流色谱分离法(high-speed countercurrent chromatography,HSCCC)是一种新的分离技术,具有许多传统的液相色谱分离手段所没有的其他优点:(1)线圈中固定相不需要载体,可避免样品在分离过程中的因使用载体而带来的不可逆吸附现象;(2)特别运用于制备性分离,每次进样体积较大,进样量也较多;(3)对样品前处理没有太多的要求,不必担心粗样会污染或损坏分离柱。

Sun等[11]用HSCCC对槐角果皮化学成分进行了较为系统的研究,并从中分离得到6种黄酮化合物,经HPLC测定纯度达到90%～99%。槲皮素、山柰酚和异鼠李素是槐角黄酮的主要成分,但由于三者的化学结构相似,特别是异鼠李素和山柰酚很难分离,单体不易制备。经一次常规HSCCC可将槲皮素与异鼠李素、山奈酚分开,但后两者不能分离。Yang等[12]利用多维高速逆流色谱分离异鼠李素和山奈酚取得了较好的效果,但需要两台高速逆流色谱仪串联使用,一般实验室难以做到。苏静等[13]利用一台高速逆流色谱仪通过循环阀将待分离部分多次泵入主机中进行循环分离,成功地分离了银杏叶中结构类似的异鼠李素和山奈酚。该方法也为槐角中黄酮化合物的分离纯化开辟了一条新的思路。

2.2 大孔树脂

大孔吸附性树脂主要以苯乙烯、α-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂甲酰胺聚合而成,多为球状颗粒。大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料,它的吸附性是由于范德华力或产生氢键的结果。大孔树脂包含许多具有微观小球的网状孔穴结构,颗粒的总表面积很大,具有一定的极性基团,使大孔树脂具有较大的吸附能力;另一方面,分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质所决定。这些网状孔穴的孔径有一定的范围,使得它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同具有一定的选择性。

袁崇均等[14]选取6种大孔树脂考察其对槐角总黄酮的吸附性能和解吸性能,结果表明D101型大孔显示出最佳的效能,静态饱和吸附量为67.78 mg◦g-1,解吸率为97.5%。本工艺使提取液的浸膏量从精制前的35%降低到7.9%,槐角总黄酮含量从18%上升为67%,精制度达到3倍多,同时槐角总黄酮的保留率为93%左右。该工艺简便可行,可用于制备高含量的槐角总黄酮。还应进一步考察不同条件下的动态吸附与解吸特征,以适应工业化大生产的要求,为槐角总黄酮开发成为降脂的5类新药提供基础。

2.3 聚酰胺树脂

对于分离黄酮类化合物,聚酰胺是较为理想的吸附剂,其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目、位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺也是一种价廉易得的化工原料,具有较好的酸碱耐受性,可利用酸碱和高浓度的醇将吸附性极强的杂质洗脱下来使其再生。

吴欣荣等[15]利用聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓粗总黄酮并考察了静态、动态吸附实验,在最佳的工艺条件下得到的产物中黄酮含量为71.84%。益母草中的黄酮含量很低,最高仅为0.327%,这使得益母草黄酮的富集和纯化难度增大。传统的大孔树脂和聚酰胺树脂精制后的产品纯度分别为9%和6.45%;将聚酰胺和大孔树脂联用可充分发挥各自优势,富集物的纯度可以提高到22%[16]。这种方法操作简便,黄酮富集效率高,具有广阔的市场前景。

目前市售的聚酰胺吸附剂主要是微米材料,对目标物的吸附作用仅依靠材料表面密布的微孔及数量有限的活性基团。相比之下,纳米材料具有更大的比表面积[17],作用位点的数量巨大,使得吸附效率和吸附容量大幅提高,少量的纳米材料即可望实现对目标物的高效富集。纳米颗粒和纳米纤维是目前纳米材料中的研究热点,其中纳米纤维在材料制备和后续器件制作方面均较纳米颗粒简便易行,便于推广应用[18]。此外,纳米纤维与其它物质的相互渗透力极强[19],分子在纤维中扩散快,从而缩短了吸附及洗脱时间。本课题组以静电纺丝法制备了聚酰胺纳米纤维作为萃取介质,成功地实现了对双酚A[20]、邻苯二甲酸酯[21]、雌二醇、炔雌醇和雌酮[22]的富集。目前聚酰胺在提纯槐角黄酮化合物方面的研究尚无相关报道,将聚酰胺纳米纤维用于分离纯化槐角黄酮化合物有一定的可行性,对此还有待进一步的研究。

3 结 语

从槐角中提取具有生理活性的黄酮作为天然药物、保健品和化妆品等行业的原料已日益引起重视,掀起了黄酮类化合物的研究热潮。随着科学技术的不断进步和发展,黄酮类化合物的提取和分离方法也将得到更加深层的研究和开发,已有的方法将会日趋成熟和完善,各种高效的新方法,尤其是基于纳米材料的提取分离技术将会成为研究和应用的热点之一。

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