不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白 P6基因真核质粒的构建及表达

何多姣,刘雪晴,李双霞,贾天军,张玉妥

(河北北方学院病原生物与免疫学研究所,河北张家口 075000)

不可分型流感嗜血杆菌 (nontypeableHaem ophilus influenzae,NTHi)是一种在人群中携带率很高的病原菌,该菌能够诱发炎症而产生多种疾病,如急性中耳炎、鼻窦炎、结膜炎和慢性支气管炎的反复发作及恶化[1]等,尤其是以其引起的急性中耳炎最为多见和严重,约 75%的儿童在 3岁之前至少患 1次中耳炎[2],NTHi一直是引起婴幼儿和儿童中耳炎的主要病原菌,约占所有报道中耳炎的 20%～40%;加之 NTHi缺乏快速准确的检测方法[3],而且其对以氨苄西林为首的β-内酰胺类等多种抗生素耐药性不断增强[4],使得临床治疗NTHi感染极为困难,因此目前亟待研究一种新型安全有效的疫苗来预防 NTHi的感染。研究证明在所有 Hi菌株 (含荚膜株及非荚膜株即 NTHi)中高度保守的外膜蛋白 P6(outermembrane protein P6,P6)可以诱导机体产生保护性的体液免疫和细胞免疫,但是 P6蛋白的获得极为繁琐且量少。近年来核酸免疫的发展为我们研制疫苗提供了新的思路,本研究就是通过克隆NTHi-P6基因,构建真核表达重组质粒 pcDNA3.1/His A-P6,为 NTHi核酸疫苗的研制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及细胞株

菌株 ATCC29247NTHi、感受态细菌 (E.coli,XL1-blue)、pcDNA3.1/His A质粒、HeLa细胞株均为本室保存。

1.2 主要试剂

限制性内切酶 B amHⅠ (50 U·μl-1)、N otⅠ(10 U·μl-1)、T4 DNA Ligase为 Takara公司产品;质粒大量提取试剂盒、脂质体、DNA Ladder DL10,000为碧云天公司产品;DNA Ladder DL22,000、Taq DNA聚合酶为凯基生物公司产品;FITC标记羊抗鼠 IgG单克隆抗体、质粒 mini提取试剂盒为 OMEGA B IO-TEK公司产品;鼠抗 NTHi-P6多克隆抗体为本实验室保存。

1.3 P6目的基因的获得

根据 GenBank提供的 86-028NP株 Hi-P6基因序列应用 Primer Premier 5软件设计 P6特异性引物,上游引物序列为 5′CGGGGATCCATCATGATG AACAAATTTG 3′,其中单下划线部分为 BamHⅠ酶切位点,双下划线部分为 Kozak序列(促进质粒真核内表达);下游引物序列为 5′ACGCGGCCGCCTATT AGTACGCT AACACT 3′,其中下划线部分为NoⅠt酶切位点,引物由金思瑞科技公司合成。通过 PCR扩增获得 P6基因,取液体脑心浸润液肉汤中培养 18 h的 NTHi菌液 10μl,加入 90μl灭菌三蒸水,100℃煮沸 10 min,瞬时离心取上清作为模板 DNA。扩增体系为 100μl:10μl 10×PCR Buffer,2μl dNTPs(10 mmo·lL-1),1.5μ上l游引物 (20μmol·L-1),1.5μl下游引物 (20μmol·L-1),1μl Taq聚合酶 (5 U·μl-1),84μl模板 DNA;反应程序:94℃预变性 5 min;94℃变性1 min,56℃退火 1 min,72℃引伸2 min,35个循环;72℃充分延伸 10 min,4℃保存 PCR产物,扩增产物经 1%琼脂糖电泳鉴定其结果。

1.4 重组质粒 pcDNA3.1/His A-P6的构建

B amHⅠ和 NotⅠ同时对 PCR扩增产物及真核载体 pcDNA3.1/HisA进行双酶切,酚-氯仿法纯化产物。将纯化的目的基因 P6与 pcDNA3.1/His A载体在 T4 DNA Ligase作用下进行连接,连接体系为 20μl∶1.0μl T4 DNA Ligase,2.0μl 10 ×T4 Buffer,3.0μl P6(12 ng·μl-1),0.5μl pcDNA 3.1/His A (12 ng·μl-1),13.5μl灭菌三蒸水;反应混合物置16℃12～16 h。次日将连接产物转化入感受态细菌 (E.coli,XL1-blue)接种至 LB固体 (氨苄抗性)培养基,37℃过夜。挑取培养基上单个菌落的一半制作模板,用目的基因 P6的特异性引物行 PCR法初步筛选阳性克隆,琼脂糖电泳验证目的基因正确后将余下的半个菌落接种至液体LB(氨苄抗性)培养基,37℃振荡培养 18 h后取阳性克隆的培养物用试剂盒小量提取重组质粒。

1.5 真核重组质粒的鉴定

1.5.1 PCR鉴定 取部分重组质粒 pcDNA3.1/His AP6用目的基因 P6的特异性引物行 PCR法扩增,而后行 1%琼脂糖凝胶电泳。

1.5.2 酶切鉴定 取部分重组质粒 pcDNA3.1/His AP6与空质粒 pcDNA3.1/HisA分别进行双酶切 (B amHⅠ、NotⅠ)后行 1%琼脂糖凝胶电泳,观察重组质粒经双酶切是否能够切出目的基因条带。

1.5.3 测序鉴定 为进一步从序列的准确性上得到验证,另取部分重组质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序,以质粒 pcDNA3.1通用引物 T7作为测序引物,并将测序结果与 GenBank中 P6基因序列进行比对。

1.6 重组质粒在真核细胞 HeLa中的表达

将 5×105个 HeLa细胞接种于放置盖片的 6孔板内,37℃、体积分数为 0.05的 CO2中培养 24 h,在细胞生长达 60%～80%时,取 2μg重组质粒 pcDNA3.1/HisA-P6、4μl脂质体转染细胞,同时将转染空质粒 pcDNA3.1/His A的细胞作为阴性对照。转染24 h后,取出 6孔板用预冷的 PBS洗涤 3次,丙酮固定10 min;PBS再次清洗 3次,10%胎牛血清室温轻摇封闭 1 h,弃封闭液,每孔加入 30μl稀释好的鼠抗 NTHi-P6多克隆抗体,4℃孵育过夜;次日,取出 6孔板 PBS清洗 3次,每孔加入 30μl稀释好的 FITC标记羊抗鼠IgG单克隆抗体 (内含 2μl Hoechst),室温避光反应1 h,PBS清洗 3次,60%甘油封片,立即于荧光显微镜下观察并记录实验结果。

2 结 果

2.1 PCR扩增 P6基因

以 NTHi全基因组为模板进行 PCR扩增,其产物于 1%琼脂糖凝胶中进行电泳,近 500 bp附近可见一条带 (图1)。

图1 NTHi-P6基因的 PCR扩增1.Negative control(ddH2O);2.NTHi-P6 gene PCR product;3.DNA LadderDL10,000Fig 1 NTHi-P6 Gene PCR amplification

2.2 pcDNA3.1/HisA-P6重组质粒 PCR、酶切鉴定

将重组质粒行 PCR扩增产物,重组质粒与空质粒一起分别进行双酶切 (B amHⅠ、NotⅠ)后产物行 1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图2。PCR可见目的基因片段;重组质粒双酶切后可见两个条带:大片段与载体 pcDNA3.1/HisA大小 (5 514 bp)一致,小片段与目的基因大小 (462 bp)一致,而空质粒中无目的条带。上述结果证明重组质粒构建成功。

2.3 测序鉴定

将重组质粒以 T7为引物进行序列分析,并采用电脑DNA分析辅助软件对所测定的DNA序列进行同源性分析。结果发现,插入的基因片段为 462 bp,结果显示有 5个碱基突变,分别为第 54(A→G)位、66(A→C)位、114(T→A)位、153(T→A)位及 159(C→T)位 ,但这些突变子均位于密码子第 3位属于无效突变,不影响蛋白质的正确表达。

图2 重组质粒 PCR、酶切鉴定结果1.DNA LadderDL22,000;2.pcDNA3.1/His A-P6 digested with BamHⅠ andNotⅠ;3.pcDNA3.1/HisA digested withBamHⅠandNotⅠ;4.Recombinant plas mids PCR productFig 2 The identification of recombinant plas m id by PCR restrictive,endonuclease enzyme

2.4 绿色荧光蛋白法检测重组质粒在真核细胞中的表达

转染 48 h后,间接免疫荧光法检测结果显示转染重组质粒 pcDNA3.1/His A-P6的细胞胞浆内有绿色荧光,而对照组无绿色荧光 (图3),提示转染细胞内表达NTHi-P6-His A融合蛋白。

图3 NTHi-P6基因表达产物鉴定1.pcDNA3.1/His A-P6 recombinant plasmids group;2.pcDNA3.1/HisA plasmids groupFig 3 Indirect i mmunofluorescence assay results of NTHi-P6 expression

3 讨 论

流感嗜血杆菌 (Haem ophilus influenzae,Hi)是一种定居于人体鼻咽部的机会性致病菌,约 2/3的健康儿童和 1/3的健康成人咽部都存在该病原菌,其易感人群主要是免疫力低下的儿童及老人。Hi可分为荚膜株及无荚膜株即NTHi;其中荚膜类的 b型流感嗜血杆菌 (Hib)曾是引起 5岁以下儿童侵袭性细菌感染的主要致病菌之一,它会导致脑膜炎、肺炎、会厌炎等疾病[5],但在 19世纪 70年代 Hib荚膜多糖疫苗应用之后,无荚膜的 NTHi成为主要的致病菌,该菌引起的中耳炎、新生儿脓毒血症、慢性支气管炎的反复发作及恶化已经成为各个国家较为严重的健康问题,随着其耐药性的增高,研制一种新型疫苗已显得尤为重要。

近年来国内外学者对 NTHi的多种菌体抗原都有研究 ,如外膜蛋白 P6/P5/P2/P26、Haps蛋白[6]、HMW蛋白[7]等,但综合各种文献,人们对 P6蛋白的研究较为透彻,P6基因序列高度保守[8],存在于所有 Hi菌株上。P6核苷酸序列和蛋白质序列在 Hi菌株间的保守性分别为 97%、100%[9];而且 P6蛋白的抗原性极强,在动物模型中,它能够激发动物体内的体液免疫及细胞免疫并产生保护性作用[10],在婴幼儿中,血清中具有杀菌活性的 P6 IgG抗体水平与其患中耳炎的机会成反比[11-12],并且具有统计学意义。因此,P6作为研制NTHi疫苗的首选目标是非常有前景的。

P6蛋白含量仅占 NTHi所有外膜蛋白的 1%～5%,其提取纯化也较复杂,为此本研究着重探讨 NTHi编码基因在真核细胞中的表达,作者以 HeLa细胞和pcDNA3.1/HisA为载体,构建以 NTHi-P6蛋白编码基因为目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1/HisA-P6,并将真核重组质粒转染 HeLa细胞,探讨其在 HeLa细胞中表达情况。实验表明:通过酶切鉴定和测序分析,pcDNA 3.1/HisA-P6构建成功,同时转染 HeLa细胞后在荧光显微镜下观察,pcDNA3.1/HisA-P6转染组可见到绿色荧光,说明重组质粒已经转染进入细胞并表达融合蛋白,上述结果为DNA疫苗的研制打下了坚实的基础。我们将在以后实验中,以上述重组质粒免疫小鼠,与 P6蛋白质亚单位疫苗一起研究其免疫效果,为NTHi疫苗的开发奠定基础。

[1]POOLMAN J T,BAKALETZL,CR IPPSA,et al.Developing a nontypeable Haemophilus influenzae(NTHi)vaccine[J].Vaccine,2000,19(1):108-115.

[2]MURPHY T F.Respiratory infections caused by non-typeable Haemophilus influenzae[J].Curr Opin Infect Dis,2003,16(2):129-134.

[3]沈军,朱启镕.流感嗜血杆菌检测的研究进展 [J].中国循证儿科杂志,2008,3(2):151-155.

[4]刘英,杨长顺,刘筱玲,等.流感嗜血杆菌临床分布与耐药性分析[J].检验医学与临床,2008,5(23):1423-1424.

[5]彭焱,贺加.中国 B型流感嗜血杆菌疾病及疫苗的应用[J].实用儿科临床杂志,2008,23(22):1785-1787.

[6]YAO F,L IW Y,KUANG Y,et al.Expression and biological activity identification of recombinant Hap protein of NTHi[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2010,30(5):953-956.

[7]W I NTER L E,BARENKAMP S J.Human antibodies specific for the High-Molecular-Weight Adhesion proteins of nontypeable Haemophilus influenzae mediate op sonophagocytic activity[J].Infect I mmun,2003,71(12):6884-6891.

[8]HOTOM IM,YAMANAKA N,SH I MADA J,et al.Intranasal immunization with recombinant outer membrane protein P6 induces specific immune responses against nontypeable Haemophilus influenzae[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2002,65(2):109-116.

[9]NELSON M B,MUNSON R S Jr,API CELLA M A,et al.Molecular conservation of the P6 outer membrane protein among strains of Haemophilus influenzae:analysis of antigenic determinants,gene sequences,and restriction fragment length polymorphisms[J].Infect I mmun,1991,59(8):2658-2663.

[10]KODAMA S,H IRANO T,NODA K,et al.A single nasal dose of fms-like tyrosine kinase receptor-3 ligand,but not peritoneal application,enhances nontypeable Haemophilus influenzae-specific long-term mucosal immune responses in the nasopharynx[J].Vaccine,2010,28(13):2510-2516.

[11]SAB IROV A,CASEY J R,MURPHY T F,et al.Breastfeeding is associated with a reduced frequency of acute otitis media and high serum antibody levels againstNTHi andouter membrane protein vaccine antigen candidate P6[J].PediatrRes,2009,65(5):565-570.

[12]YAMANAKA N,HOTOM IM,B I LLAL D S.Clinical bacteriology and immunology in acute otitis media in children[J].Infect Chemother,2008,14(3):180-187.