mi RNA-30c的研究进展

徐晓峰,周怀君

(1.东南大学医学院,江苏南京 210009;2.南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科,江苏南京 210008)

1 miRNAs的定义与产生

miRNAs是一类长度为18～24个核苷酸的可调控基因表达的内源性非编码单链小分子RNA,通过与靶mRNA的3′非翻译区域即3′UTR特异性结合,引起靶mRNA降解或者翻译抑制,产生转录后基因沉默。miRNAs调控靶mRNA的方式取决于miRNAs与靶mRNA的互补程度。当互补完全或者接近完全时引起靶mRNA降解,多见于植物miRNAs,也可见于哺乳动物miRNAs,而大多数动物miRNAs通过形成不完全的互补位点抑制mRNA转录后翻译。多数的人miRNAs位于蛋白编码基因的内含子或非编码mRNA转录片段中,其余miRNAs在基因组中离其他转录本较远,如位于非编码mRNA基因的外显子中,或mRNA基因的3′UTR中,或成群聚集在其他miRNAs基因中[1]。

编码miRNAs的基因由RNA聚合酶Ⅱ转录后形成大的RNA前体分子(pri-miRNA),它在细胞核内被RNA酶ⅢDrosha和双链RNA结合蛋白Pasha加工,产生一段具有发夹环结构的长度为70～80个核苷酸的miRNA前体(pre-miRNAs)。Pre-miRNAs被RNA GTP-依赖的转运体exportin5转运至胞浆,在另一个RNA酶ⅢDicer剪切下形成18～24个核苷酸的不完全互补的双链RNA,通常称为miRNA:miRNA*双链。双链解开后,成熟的miRNA单链被整合到RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)中,通过与靶基因互补配对,对靶基因进行负调控[1-2]。

miRNA-30家族作为miRNAs的重要组成部分,在人类和动物miRNA的功能研究中起着不容忽视的作用。人类和鼠类miRNA-30家族包括有miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d、miRNA-30e 5个成员,现对其中成员之一miRNA-30c的相关研究进展作一综述。

2 miRNA-30c的起源

人类miRNA-30c(即has-miRNA-30c,以下简称miRNA-30c)根据来源的染色体不同可分为miRNA-30c-1和miRNA-30c-2,miRNA-30c-1基因来源于1号染色体,和miRNA-30e同簇,而miRNA-30c-2基因则来源于6号染色体。2002年,Lagos-Quintana等[3]通过组织特异性克隆对小鼠不同组织的miRNA进行检测,首次在小鼠的心脏和脑部组织中确认了miRNA-30c,即mmu-miRNA-30c。2004年,有研究人员[4]在未经12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)诱导分化的人类髓样白血病细胞系中发现了miRNA-30c的隔离群,这是成熟miRNA-30c在人类细胞中存在的首次证实。随后,人们对于miRNA-30c的相关研究不断深入。成熟的miRNA-30c可从pre-miRNA-30c-1或者pre-miRNA-30c-2发展而来,Iwai等[5]证实了在人类中部分成熟的miRNA-30c是来自pre-miRNA-30c-2基因,另外,他们还发现大多数变异的pre-miRNA不能在miRNA成熟过程中起作用,只有成熟的miRNA-30c-2中延续存在着pre-miRNA-30c-2中的变异序列。这种多态性可能会改变靶目标的选择,从而引起更深的生物学效应。

3 miRNA-30c在不同组织中的认识

3.1 miRNA-30c与血液系统

miRNA与血液病学间的联系首先是由Calin等[6]在有关miRNA基因在慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)病例中缺失的研究中建立起来的。而miRNA-30c与血液系统关系的研究报道首先见于2008年Bruchova等[7]对真性红细胞增多症的研究,他们采用real time PCR技术通过对真性红细胞增多症病人和正常人外周血进行miRNA检测后发现,在真性红细胞增多症病人的网织红细胞中miRNA-30c呈低表达。为了分析JAK2 V617F等位基因(在真性红细胞增多症病人骨髓或者外周血髓样细胞中的阳性表达 ＞95%)和miRNA表达的关系,他们把病人分成两组,一组为JAK2 V617F基因低负荷组(负荷小于50%),另一组为高负荷组(负荷高于50%),结果显示高负荷组病人粒细胞中miRNA-30c表达明显低于正常对照组,而低负荷组又明显高于高负荷组,提示在真性红细胞增多症病人中粒细胞JAK2 V617F等位基因的阳性表达和miRNA-30c呈负相关。这说明miRNA-30c的抑制表达可能对真性红细胞增多症具有促进作用,检测和针对miRNA-30c的应用治疗在今后有可能为真性红细胞增多症诊断和治疗提供一定的帮助。

随后Ben-Ami等[8]研究发现,造血干细胞的重要分化调节因子Runx1基因的3′UTR存在包括miRNA-30c在内的5种miRNAs(miRNA-27a、miRNA-9、miRNA-18a、miRNA-30c和miRNA-199a)的结合位点,miRNA-30c等与其结合后可引起转录后Runx1的低表达,从而可能导致血液细胞分化的异常。

3.2 miRNA-30c与肝胆系统

miRNA-30c与肝胆系统的研究报道也始于2008年,从小鼠肝胆系统延伸至人类肝胆系统,从正常生理状态延伸至微生物感染后的病理状态,可见miRNA-30c与肝胆系统的联系是非常紧密的。Hand等[9]对各个发育时期的小鼠肝脏进行miRNA检测,发现mmu-miRNA-30c等随着小鼠胚胎发育到成熟在肝脏中不断堆积。在胚胎期小鼠肝脏胆管板中,采用免疫荧光技术可观察到mmu-miRNA-30a和mmu-miRNA-30c呈高表达。而随着小鼠的成熟,mmu-miRNA-30a和mmu-miRNA-30c在胆管中的表达逐渐减少,在成熟的小鼠胆管内未检测到这两种miRNA。同样的,在正常人肝脏中miRNA-30a和miRNA-30c也是主要在胆管细胞中表达。

而Zhou等[10]在针对隐孢子虫感染刺激上皮细胞产生免疫应答的研究中,利用miRNA芯片技术发现暴露于隐孢子虫的胆管上皮细胞在感染12 h后包括miRNA-30c在内的多个miRNA表达呈显著增高。为进一步检测隐孢子虫感染后是否通过NF-kappaB p65依赖途径增强miRNA基因的转录表达,他们利用IKK2抑制因子阻断p65相关的NF-kappaB转录激活途径,采用real time PCR分别检测NF-kappaB p65依赖途径阻断及未阻断细胞pri-miRNAs表达情况,结果显示胆管上皮细胞感染隐孢子虫后pri-miRNA-30c-1表达增高,在阻断其NF-kappaB p65依赖途径后未见其抑制现象;而pri-miRNA-30c-2则均未见明显过表达。Zhou等推测胆管上皮细胞在感染隐孢子虫后,可能通过其它或者包括NF-kappaB p65依赖途径在内的多种途径激活miRNA的转录表达。这些研究提示miRNA-30c可能与肝胆系统,特别是胆道结构功能有着密切联系。

3.3 miRNA-30c与神经系统

大量的miRNA从神经细胞中分离出来,这些miRNAs如同其他组织中miRNA一样,与转录后翻译调节有关。有研究表明包括miRNA-30c在内6种miRNA(miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-99a、miRNA-99b、miRNA-138-2和miRNA-140)的表达水平可以用于区别垂体微腺瘤和大腺瘤的组织学分-型[11]。药物可以引起相应的组织学或者血清学蛋白水平的改变,同样也可能引起miRNA水平的改变,Zhou等[12]在长期使用情绪稳定药物(lithium和VPA)对小鼠神经组织影响的研究中,利用miRNA芯片技术对小鼠海马区域组织miRNA进行检测,然后针对其中改变明显的部分miRNA进行real time PCR定量检测,结果发现小鼠在长期行情绪稳定药物治疗后其海马组织中包括mmu-miRNA-30c在内的多种miRNA呈下调水平。据此Zhou等认为药物诱导的基因表达改变不一定是从蛋白水平反映,这为以后研究药物作用影响提供了新思路。

3.4 miRNA-30c与结缔组织

miRNAs是通过转录后基因表达沉默来发挥调控作用的,结缔组织生长因子(CTGF)mRNA中包含有种系发育过程中的miRNA-30c的保守性结合位点,miRNA-30c经与其位点的结合,通过翻译抑制和mRNA降解负性调节CTGF,从而抑制心肌细胞和成纤维细胞中的CTGF蛋白的过表达。左心室肥大病人的心脏中miRNA-30c呈低表达,推测可能正是由于miRNA-30c的减少导致了心脏中CTGF蛋白的堆积和组织纤维化[13]。

4 miRNA-30c与肿瘤

从研究利用RNA干扰技术来阻滞癌症等疾病开始,越来越多的线索表明miRNA与癌症之间存在着密切的关系。部分miRNA已被证实在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点,对于miRNA基因的分析,可能促进对癌症等重大疾病发病机制的理解。许多研究表明miRNA-30c与肿瘤也有着非常密切的联系。

4.1 miRNA-30c与原癌基因

2008年,Chang等[14]采用miRNAs芯片技术对人和小鼠中经Myc(原癌基因)诱导的B淋巴细胞进行检测,出乎意料的是多种miRNA表达都受到抑制。为了进一步确认,他们采用了RNA印迹法检测,结果和miRNA芯片检测结果一致。而对比较复杂的miRNA-30家族,他们将其分成miRNA-30a/miRNA-30c-2、miRNA-30d/miRNA-30b和miRNA-30e/miRNA-30c-1 3簇,采用特异性RNA印迹法(通过杂交探针生成相同寡核苷酸序列)进行检测,结果miRNA-30a未被检测到,提示miRNA-30a/miRNA-30c-2簇在这些细胞中可能未表达,而其他两簇在Myc诱导下都呈低表达。另外,他们在用shRNA(short hairpin RNA)抑制Myc后,包括miRNA-30c在内的多种miRNA又呈高表达。这些证据说明包括miRNA-30c在内的多种miRNA抑制对Myc诱导的肿瘤生成具有促进作用。

4.2 miRNA-30c与乳腺癌

自从人类发现HPV感染与宫颈癌的发生发展有着直接关系以来,HPV筛查早期预防宫颈癌已取得一定效果,以致于很多大城市女性乳腺癌发病率已超过宫颈癌,成为危害女性健康的最大杀手,针对乳腺癌发病机制及相关的临床研究已迫在眉睫。

2009年,Shen等[15]对42例家族性乳腺癌患者进行了17种被认为是调节主要乳腺癌基因的miRNA变异体筛查,其中包含有miRNA-30c-1,他们在1例没有BRCA1/2突变基因(乳腺癌易感基因)的病例中发现了pre-miRNA-30c-1的变异(G to A),并且发现了它相对不稳定的二级结构上的改变,他们还证实了这种pre-miRNA-30c-1的多态性增加了成熟miRNA-30c的生成。为了确认这种稀有的变异是否也存在于正常人群中,他们同样检测了100例健康女性,结果在健康人群中未检测到这种变异。从而推测这种稀有的变异可能仅仅存在于乳腺癌患者中,也就是说这种变异可能是导致家族性乳腺癌发生的原因之一。

有研究人员[16]对246例雌激素阳性的接受他莫昔芬治疗的早期乳腺癌病例进行了miRNAs的检测,统计学单变量分析显示高表达的miRNA-30c、miRNA-30a-3p和miRNA-182等3种miRNAs与他莫昔芬治疗后的临床利益和无进展生存时间呈明显相关性,而针对校正后传统预测指标的多变量分析则显示只有miRNA-30c可以作为独立预测值(P值小于0.01),也就是说该研究提示miRNA-30c的表达水平可作为独立指标预测早期乳腺癌患者经他莫昔芬治疗所产生的临床意义,即miRNA-30c表达高的早期乳腺癌病人经他莫昔芬治疗后预后相对较好,低表达者则反之。他们的研究还显示miRNA-30c的表达与HER和RAC1两条信号传导通路存在一定关系。

4.3 miRNA-30c与结直肠癌

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,针对于结直肠癌的miRNA研究还不是很多,2006年,Xi等[17]采用qRT-PCR方法对48例结直肠活检标本(其中24例为结直肠癌组织标本,24例为正常人组织标本作为对照)中的let-7b、let-7g、miRNA-15b、miRNA-181b、miRNA-191、miRNA-200c、miRNA-26a、miRNA-27a、miRNA-30a-5p和miRNA-30c进行检测,结果显示在结直肠癌标本中只有miRNA-15b、miRNA-181b、miRNA-191和miRNA-200c 4种miRNA呈过表达,而未见到miRNA-30c的明显高表达。作者认为在不排除miRNA-30c与结直肠肿瘤生成相关的前提下,miRNA-30c是否更倾向于具有抗肿瘤作用。

4.4 miRNA-30c与膀胱癌

多种膀胱癌发生相关因子已被认可,如Rb蛋白、成纤维细胞生长因子受体等,但对于引起这些因子表达增加或下调的相关分子调控机制还不是很清楚,Wang等[18]从miRNA水平对7个膀胱癌患者肿瘤组织和正常黏膜组织(取自病变组织对侧)进行了芯片筛检和real time PCR定量检测,均发现肿瘤组织每个样本中包括miRNA-30c在内的4种miRNAs(miRNA-26a、miRNA-29c、miRNA-30c和miRNA-30e-5p)表达都明显低于相对应的正常组织。所以推测miRNA-30c等可能对肿瘤具有抑制作用,其低表达可能导致了膀胱癌发生与进展。

4.5 miRNA-30c与髓母细胞瘤

髓母细胞瘤是好发于儿童的颅内恶性肿瘤,是中枢神经系统恶性程度最高的神经上皮性肿瘤之一,由于该肿瘤生长极为迅速、手术不易彻底切除,并有沿脑脊液产生播散性种植的倾向,使得本病的治疗比较困难,预后很差。Ferretti等[19]对34例原发性髓母细胞瘤患者、9名正常成人及5例正常胎儿的小脑组织进行了miRNAs的测定,结果发现包括miRNA-30c在内的多种miRNA在原发性髓母细胞瘤中相对于正常成人或胎儿的小脑组织呈低表达,提示这些miRNAs可能存在一定的抗肿瘤生成作用。

4.6 miRNA-30c与妇科肿瘤

miRNA-30c与妇科肿瘤关系的研究并不是很多,Boren[20]等对61例子宫内膜样本(37例子宫内膜癌,4例不典型增生内膜组织,20例正常内膜组织)进行了miRNAs的基因芯片检测,他们发现随着正常子宫内膜组织向不典型增生、内膜癌进展,miRNA-let 7i、miRNA-221、miRNA-193、miRNA-152和miRNA-30c表达量逐渐 降低;而miRNA-185、miRNA-106a、miRNA-181a、miRNA-210、miRNA-423、miRNA-103、miRNA-107和miRNA-let 7c 8种miRNAs则逐渐增加。而后,他们对miRNA-Let-7i、miRNA-185、miRNA-103、miRNA-30c和miRNA-107等6种miRNAs进行定量检测,出乎意料的是miRNA-30c的表达在肿瘤组织和正常组织中没有明显差异。另外,他们还检测到在子宫内膜癌样本和正常内膜组织样本中90种mRNA基因的表达存在差异,通过Sanger数据库搜索发现其中26种基因为miRNAs的预测靶基因,其中MYH11、GPRASP2、DDR2为miRNA-30c预测靶基因。

2007年,Lui等[21]对6组宫颈癌细胞株(5种HPV阳性细胞:SW756、C4I、CaSki、SiHa、ME-180;1种HPV阴性细胞:C33A)和5组正常宫颈细胞株进行了miRNA检测,发现其中miRNA-30c在3组宫颈癌细胞株中(SW756、C4I、ME-180)相对于正常细胞呈较高表达。miRNA-30c可能与宫颈癌的发生存在一定的关系,有待进一步研究。

Sorrentino等[22]发现在耐化疗药(紫杉醇和顺铂)的卵巢癌细胞株中,miRNA-30c、miRNA-130a和miRNA-335等3种miRNAs都呈低表达,说明他们可能在抵抗耐药性的形成过程中起着重要作用。

miRNA-30c与妇科恶性肿瘤之间可能存在着密切的关系,也有研究[23]提示在作为妇科良性肿瘤代表的子宫肌瘤中miRNA-30c的表达是低于正常子宫平滑肌组织的,故miRNA-30c的抑制表达可能与肌瘤形成和发展也存在着一定联系。

5 小 结

综上所述,miRNA-30c在人类多种肿瘤组织中呈低表达,以此推测它很可能在这些组织中起到一定的抗肿瘤作用,即对多种肿瘤起着负性调节作用。但并非所有研究都支持此观点,Busacca等[24]在针对两种不同形态的恶性间质瘤细胞株MPP-89(梭形)和REN(上皮样)进行miRNA水平检测时发现,miRNA-30c在两种细胞株中相对于正常间皮细胞均呈高表达,他们还发现在肉瘤样间皮瘤病例中,较低表达miRNA-30c和miRNA-17-5p的病人存活时间相对较长。同样,上文已提到Lui[21]的研究显示部分宫颈癌细胞株中miRNA-30c亦呈高表达。这与大多数研究结果支持miRNA-30c具有抗肿瘤作用是相反的。我们相信miRNA-30c发挥的强大的功能调节作用不仅仅停留于上文所提到的部分组织或肿瘤。Reddy等[25]在对猪的不同组织进行miRNA检测分析后发现,包括ssc-miRNA-30c在内的4种miRNAs(ssc-miRNA-22、ssc-miRNA-26b、ssc-miRNA-29c和ssc-miRNA-30c)在猪的14种不同组织(心脏、肺、肝、胃、胸腺、淋巴结、子宫、卵巢、子宫内膜、膀胱、睾丸、胰腺、唾液腺和脾脏)中都普遍存在。以此推测,在人类的多种不同组织中可能也有miRNA-30c的普遍存在,但目前研究资料还不够,尚需更多的研究证实,其在不同组织器官及肿瘤中发挥的功能作用还需要更多的研究支持证明。特别是miRNA-30c可能在某些组织中具有一定的抗肿瘤作用,伴随着日益完善的分子生物学和基因工程技术,相信不久的将来其应用于预防、诊断及治疗包括肿瘤在内的各种疾病的新方法会给人类带来新的希望。

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