噬菌体展示随机肽克隆的一种快速、高通量测序技术

杨芳,张文红

(1.安康学院农学与生命科学院,陕西安康 725000;2.第四军医大学基因诊断技术应用研究所,陕西西安 710032)

随机肽库主要包括噬菌体展示随机肽库、大肠杆菌展示随机肽库和核糖体展示随机肽库三大类,它们在抗原表位分析、生物大分子相互作用位点分析、小分子肽疫苗设计及先导化合物的筛选等研究工作中已得到广泛应用。随机肽库淘筛一般会筛到大量的克隆,但要得到有意义的随机肽序列则必须进行大量的测序工作。使用常规DNA测序技术过程较为繁杂,费用也比较高。本研究基于焦磷酸微测序 (Pyrosequencing)技术,建立一种针对噬菌体展示随机肽的高通量序列测定方案。

1 材料与方法

1.1 材料

环 7肽噬菌体展示随机肽库试剂盒 (Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit)购自美国 New England Biolabs公司,PSQ96序列分析系统、Pyrosequencing试剂盒 (SQA Reagent Kit)购自瑞典 Pyrosequencing AB公司。多肽区上游 PCR引物为 5′-attattattcgcaattcctttagt-3′,下游 PCR引物为 5′-ccacagacagccctcatagtt-3′(5′末端标记生物素);微测序引物为 5′-acctttctattctcactctgctt-3′。

1.2 方法

1.2.1 环 7肽噬菌体展示随机肽库的淘筛 以链亲合素为筛选配基、生物素为洗脱液筛选链亲合素的结合肽基序。每一轮淘筛的肽库用量为 2×1011个噬菌粒,淘筛富集及扩增过程按照肽库试剂盒操作说明书进行,共淘筛 3轮。

1.2.2 微测序模板的制备 第 3轮淘筛的噬菌体洗脱液,滴度测定后从 LB/IPTG/X-gal板上随机挑选10个蓝色噬菌斑作为模板,PCR扩增随机 7肽区序列:50μl反应体系中 10×PCR反应缓冲液5μl、25 mmol·L-1MgCl23μl、dNTPs的终浓度为125μmol·L-1、PCR引物的终浓度为 0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶 2.5 U。PCR反应采用热启动,反应条件为:95℃预变性 5 min;然后 94℃变性 30 s,50℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共进行 45个循环;72℃延伸 5 min。随机选 5例 PCR扩增产物,取 5μl在 1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。分别取 45μl PCR扩增产物转移于 PSQ96微孔板中,加入 100μg链亲合素包被磁珠和 45μl结合缓冲液 (10 mmol·L-1Tris-HCl,2 mol·L-1NaCl,1 mmol·L-1EDTA,0.1%Tween20,pH 7.6),65℃温育15 min,固定 PCR产物。然后在0.5 mol·L-1NaOH中使 PCR产物解离为单链,用PSQ96样品制备工具分离单链DNA。

1.2.3 Pyrosequencing测序 用 40μl退火缓冲液(20 mmol·L-1Tris-Acetat,2 mmol·L-1MgAc2,pH 7.6)悬浮单链 DNA模板并转移于 PSQ96 Plate Low板中,向模板中各加入 5μl 3μmol·L-1的测序引物,80℃加热 2 min,冷却至室温,将适量的酶混合物、底物混合物、dATPαS、dTTP、dCTP和 dGTP分别加于试剂舱中,并将 PSQ96 Plate Low板置于 PSQ96序列分析仪中进行测序分析。测序分析时的碱基分配顺序为GCAT,共进行 24个循环,其他参数采用 Pyrosequencing的标准参数。

2 结 果

第 3轮淘筛的噬菌体洗脱液滴度为 2×107pfu·ml-1。噬菌体随机肽克隆 PCR扩增后,均得到 205 bp大小的特异性扩增产物,无非特异产物 (图1),满足下一步的测序需要。应用 Pyrosequencing技术对 10例样品的随机 7肽区进行序列分析,得到一个GXXXHPQ的同源基序 (X为任意氨基酸),此基序为链亲合素的结合肽基序,结果与预期相符合。

图1 噬菌体随机肽克隆的 PCR扩增Fig 1 Amply random peptide fragment by polymerase cha i n reaction

3 讨 论

Pyrosequencing技术是一种短序列的微测序技术。测序反应所需的待检测基因模板为单链 DNA,其制备原理为:对应于待测单链的 PCR引物标记生物素,PCR产物和生物素的配体——链亲合素包被的磁珠混合,同时在变性液中使双链 DNA解离为单链,再在磁场中纯化得到标记有生物素的单链待测模板。单链待测模板和测序引物退火结合,随后逐一加入 4种dNTP进行引物的延伸反应。当 dNTP掺入时将释放焦磷酸基团 (PPi)。ATP硫酸化酶在 APS底物的存在下可以催化焦磷酸形成 ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,同时释放出可见光信号。光信号由冷 CCD摄像机检测,强度经软件分析后反应为一个峰高。由于酶级连反应的每一步均与上一步存在量的正比依赖关系,每个光信号的峰高将与反应中掺入的 dNTP量成正比。ATP和未掺入的 dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号并再生反应体系,完成一个循环 (若加入的 dNTP不能配对掺入则再生反应,加入下一种 dNTP,直至有碱基掺入)。以上步骤循环进行中DNA链不断延伸合成,从信号峰的顺序及强度可以读出所检测的序列[1-2]。

运用 Pyrosequencing技术进行微序列测序具有以下优点:(1)操作简易快速,测序过程可以实时检测,不需等候;(2)高通量,采用 96孔板,1 h即可完成 96个样品的测序;(3)与常规方法相比测序成本低,可以大大降低研究费用。此外,噬菌体展示随机肽测序时无需培养、制备单链噬菌体,可以使操作进一步简化。Pyrosequencing技术可以准确读取的序列长度在 30 bp以上,如果进一步优化条件,甚至可以准确读取 200 bp的序列[3]。常见随机肽库主要有随机 7肽库、随机 9肽库和随机 15肽库等,其 DNA序列长度在 20 bp到50 bp之间,因而,此技术必定可以广泛应用于各种随机肽库的筛选测序。

[1]RONAGH IM,KARAMOHAMED S,PETTERSSON B,et al.Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release[J].AnalyticalBiochemistry,1996,242(1):84-89.

[2]RONAGH IM,UHLEN M,NYREN P.A sequencing method based on real-ti me pyrophosphate[J].Science,1998,281(5375):363-365.

[3]RONAGH IM.Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing[J].Genome Research,2001,11(1):3-11.