酶法降解壳聚糖及产物应用研究进展

窦 屾，廖永红，杨春霞，任文雅，徐 瑾

(北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

酶法降解壳聚糖及产物应用研究进展

窦 屾，廖永红*，杨春霞，任文雅，徐 瑾

(北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

壳聚糖是一种天然生物多糖，它来源于自然界中含量丰富的甲壳素。经过降解后，低聚合度水溶性壳聚糖展现出优良的生物活性。对利用专一性酶和非专一性酶制备低聚水溶性壳聚糖及其水解产物的应用进行了介绍，并且提出了进行工业化生产需要重点研究的方面。

壳聚糖，酶解，低聚水溶性壳聚糖

甲壳素(chitin，2－氨基－2脱氧－D－葡聚糖)是一种广泛存在于生物界的天然多糖。壳聚糖(chitosan)是指甲壳素脱乙酰度在55%以上的多糖，它是2－氨基－2－脱氧－D－葡糖和2－乙酰氨基－2－葡糖两种单体通过 β－1，4糖苷键连接的多糖混合物［1－2］。壳聚糖及其衍生物可广泛应用在食品、生物医药和化妆品中［3－4］。这些具有生物活性的壳聚糖多为低聚物，因此由高聚壳聚糖降解制备低聚壳聚糖成为研究热点。国内外降解壳聚糖的方法主要分为化学法、物理法和酶法。化学法主要通过无机强酸和H2O2等氧化性极强的基团，断裂壳聚糖的β－1，4糖苷键得到壳聚糖低聚物，该反应不易控制，环境污染严重［5］;物理法主要包括超声波降解法、微波降解法和光降解法等，分别通过超声波引发的机械力、微波加热引起的分子震动和摩擦、H2O2吸收光产生自由基等作用断裂β－1，4糖苷键使得壳聚糖降解，该反应过程存在产物收率低和反应不完全等缺点［6］。酶法降解壳聚糖是通过专一性酶和非专一性酶降解高聚壳聚糖制备低聚壳聚糖的方法，其中专一性酶主要指壳聚糖酶，非专一性酶包括脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶和溶菌酶等。酶法降解壳聚糖有反应条件温和且容易控制、安全性高、环境污染少和能得到特定聚合度产物等优点。与化学法和物理法降解壳聚糖相比，酶解所得低聚壳聚糖已经成为工业化制备具有生理活性壳聚糖最有前景的方法。但是酶解壳聚糖反应过程复杂，反应机理目前尚不十分清楚，还需要人们继续探索。本文对专一性酶和非专一性酶降解壳聚糖以及壳聚糖酶解产物的应用进行如下概述。

1 专一性酶降解壳聚糖

壳聚糖酶(chitosanase)是专一性降解壳聚糖的酶，Monaghan［7］最先发现它可以专一性的降解壳聚糖而不降解呈胶态的甲壳素。该酶多存在于真菌细胞如青霉菌中，少量存在于细菌如芽孢杆菌等生物中。真菌中产壳聚糖酶的菌株较多，如青霉菌和假单胞菌等。方祥年等［8］从诱变得到的球孢白僵菌Beauveria bassiana 1316－V1的培养液中分离纯化得到分子量为36ku，比活力为45U/mg的壳聚糖酶。葛正红等［9］从青霉菌(Penicilium sp.)的发酵液中分离得到纯化182倍的壳聚糖酶，该酶的比活力为1020U/mg。郑连英等［10］用抗生素和紫外光诱变青霉菌Penicillium sp.ZD－Z1，从它的发酵液中得到酶活力为1.58U/mL的壳聚糖酶粗酶液。王艳等人［11］从变异的假单胞菌发酵液中得到酶活力为3.0U/mL的壳聚糖酶粗酶液。专家对细菌产壳聚糖酶的研究较少，王平平等［12］从细菌的发酵液中得到壳聚糖酶，并对它的性质进行了初探。叶淑红等［13］对实验室分离的细菌Streptomyces BK2进行发酵得到的粗酶液的酶活力为1.29U/mL。

自然界中每年可以产生的十亿t甲壳素，这些甲壳素可以直接被甲壳素酶(chitinase)降解或者经过脱乙酰基再被壳聚糖酶降解。

1.1 壳聚糖酶降解壳聚糖

虽然很多真菌和细菌等微生物都能产生壳聚糖酶，但是不同来源的壳聚糖酶降解壳聚糖的最佳工艺条件各不相同。方祥年等［8］用球孢白僵菌Beauveria bassiana发酵得到壳聚糖酶，它的最适反应条件是温度60℃，pH 4.0。该酶在37℃以下、pH2.0～5.0之间稳定性好，Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ni2+是它的强抑制剂，Ag+、Mn2+对它也有较强抑制作用，Fe2+有轻微激活作用。葛正红等［9］用青霉菌(Penicilium sp.)发酵得到壳聚糖酶，该酶降解壳聚糖最适条件为50℃和pH 5.0，金属离子Mg2+和Ca2+对酶活力有一定的促进作用，重金属离子Cu2+、Ni2+和Zn2+对酶有较强的抑制作用。李风平［14］等人应用平板透明圈法从19株腐皮镰孢菌(Fusarium solani)中筛选出产壳聚糖酶的菌体(0114)，发现该酶的最适反应温度为50℃，如果在50℃下加入该酶45mU/mL降解壳聚糖6h，降解率可达26.7%，酶解产物经薄层层析分析表明其中低聚壳聚糖含量较高。方文建等［15］利用Penicillium sp.ZD－Z1发酵生产的壳聚糖酶制备低聚壳聚糖，结果发现30℃、pH 5.0、加酶量0.01U/mL和底物浓度4%是该酶制备低聚壳聚糖的最佳条件。叶淑红等［13］用细菌发酵的粗酶液降解壳聚糖，发现在温度30℃和pH 6.0水解壳聚糖48h能得到不同聚合度的低聚壳聚糖。

不同来源的壳聚糖酶水解壳聚糖的最佳条件不同，但是不同壳聚糖酶最适底物的脱乙酰度和酶解产物的聚合度却大体相同。Fenton等［16］用脱乙酰度70%和 40% 的壳聚糖为底物，经过 Penicillium islandicum壳聚糖酶降解得到了聚合度为3的N－乙酰基壳聚糖和聚合度为2的低聚壳聚糖，并且产物的末端都是N－乙酰氨基葡糖基团。Takiguchi［17］用芽孢杆菌属SP.7－M菌株所产生的壳聚糖酶降解壳聚糖，产物为聚合度2～5的低聚壳聚糖，他发现以不同聚合度壳聚糖为底物经过壳聚糖酶降解产物也会不同。Izume等［18］从脱乙酰度70%、76%、84%、90%的壳聚糖中筛选出能够通过壳聚糖酶降解得到壳五糖、壳六糖或者壳七糖的底物，他们发现脱乙酰度在90%到84%的壳聚糖是最佳底物。Hutadiolk等［19］发现在非均相中脱乙酰度不是很高的壳聚糖更容易被酶水解，但是当脱乙酰度比较小时，底物基本不能被水解。陈小娥等［20］用壳聚糖酶ChinB降解壳聚糖得到产物的聚合度以3～5为主。

1.2 壳聚糖酶降解壳聚糖机理

壳聚糖酶主要分为内切型和外切型两种类型，现在被研究的大部分是内切型壳聚糖酶。这是因为内切酶可以随机切断壳聚糖的β－1，4糖苷键得到相应的低聚物，十分适合于制备低聚壳聚糖，而外切酶只能从糖链的非还原末端逐个切下单糖残基，得到的产物是单糖［21］。Fukamizo等［22］研究发现两种不同来源的壳聚糖酶均可以通过酶解相同的底物生成N－乙酰氨基葡糖在还原端而氨基葡糖在非还原端的杂化低聚糖、氨基葡糖二聚体以及N－乙酰氨基葡糖三聚体。这表明壳聚糖酶可以断裂N－乙酰氨基葡糖与氨基葡糖之间、两个氨基葡糖之间的糖苷键。并且他还猜想壳聚糖酶催化部位附近有两个亚单位，其中一个只能结合氨基葡糖不能结合N－乙酰氨基葡糖，另一个两者都可以结合。吴绵斌等［23］用四阶定步长Runge－Kutta方法结合Powell优化方法对里氏木霉ATCC56764产生的壳聚糖酶随机进攻动力学模型进行了计算，得到了模型参数的优化值。模型计算结果表明，随机进攻动力学模型能够合理地描述和解释酶法降解的过程。陈小娥等［20］研究表明，壳聚糖酶内切作用于两个氨基葡糖之间、氨基葡糖与N－乙酰氨基葡糖之间的糖苷键，然而却不能断裂两个N－乙酰氨基葡糖之间糖苷键。

由此可见，壳聚糖酶多以内切方式降解壳聚糖，它的最适温度是30～60℃，最适pH2～5。Cu2+和Ni2+是壳聚糖酶抑制剂，酶的最适底物为脱乙酰度在80%～90%的壳聚糖，产物为聚合度在10以下的低聚壳聚糖。由于壳聚糖酶价格十分昂贵且发酵得到的壳聚糖酶酶活力比较低，这种酶不适宜大规模生产和应用，只能停留在实验室研究阶段。

2 非专一性酶降解壳聚糖

因为壳聚糖酶的价格很高且无法进行工业化生产，所以很多研究者开始研究价格较低且降解壳聚糖能力较强的非专一性酶。Pantaleone等人［24］首次发现不同来源的非专一性酶对壳聚糖都有降解作用。后来Yalpani［25］发现非专一性酶中有的酶对壳聚糖的降解活性与壳聚糖酶相似，有的酶甚至超过了壳聚糖酶。目前降解壳聚糖的非专一性酶主要包括溶菌酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等。

2.1 溶菌酶

溶菌酶(lysozyme)存在于鸡蛋蛋白、人唾液以及眼泪和体液中，它能水解甲壳素、壳聚糖和细菌细胞壁的粘多糖等。很多研究者对溶菌酶降解壳聚糖的最适条件进行了研究。周孙英等［26］通过实验发现，以壳聚糖为底物的溶菌酶酶解反应符合米氏方程，反应的最适宜温度为50℃，pH 8.0，并且壳聚糖的脱乙酰度越低降解速度越快。马如等［27］研究了溶菌酶降解壳聚糖的条件，该酶的最适反应条件是温度45℃，pH 5.0，一定浓度的Cu2+、Zn2+、Ba2+、Cr3+可作为溶菌酶的促进剂，而K+、Ca2+和高浓度的Zn2+则起到抑制剂的作用。张立彦等［28］研究了溶菌酶对壳聚糖的降解条件，结果表明，脱乙酰度约70%的壳聚糖易被溶菌酶水解，酶解最佳条件是温度55℃、pH 4.0，在水解反应初期溶液中还原糖浓度迅速增加，水解6h后还原糖的含量可达6.758mmol/L，酶解液中还原糖浓度与壳聚糖的浓度呈线性关系。

此外，也有很多对溶菌酶最适作用底物和酶解产物的报道。Nishimura等［29］实验发现用溶菌酶降解O－羧甲基取代的甲壳素(取代度为80%)，底物粘度下降很快。Ishiguro等［30］发现溶菌酶可以将聚合度很高的(通常大于1000)部分脱乙酰基的壳聚糖水解成聚合度在10左右的低聚壳聚糖，并且他们还发现溶菌酶的一个亚单位(D)对含N－乙酰基葡糖单位的壳聚糖很敏感。Kjell M Varum等人发现［31］溶菌酶对壳聚糖的作用会随着壳聚糖乙酰化程度的升高而升高，而完全脱乙酰基的壳聚糖不能被溶菌酶降解，这个结果为人体的壳聚糖植入技术提供了理论依据。

从前面的研究报道中可以看出，溶菌酶在温度40℃到60℃、pH4.0～8.0时表现出对壳聚糖良好的降解能力。它的最适底物是脱乙酰度在70%～80%的壳聚糖，而完全脱乙酰的壳聚糖不能被它降解，产物为聚合度10左右的低聚壳聚糖。

溶菌酶在对壳聚糖的降解方面有很好的开发潜力，它在人体当中就存在且有杀菌消炎的作用。深入研究它的反应原理可让其在低聚壳聚糖的工业化生产上发挥更大的作用。

2.2 纤维素酶

纤维素酶(cellulose)是指对纤维素有催化作用的一种酶。壳聚糖和纤维素分别是壳聚糖酶和纤维素酶的底物，它们在结构上十分相似，都是D－葡糖单元由β－1，4糖苷键连接，区别在于它们糖环上2位的基团分别为氨基(乙酰氨基)和羟基。由于壳聚糖酶和纤维素酶的底物十分相似，两种酶的性质可能相差不大。

关于纤维素酶降解壳聚糖的最佳工艺研究有很多，如陈盛等［32］实验发现纤维素酶能很容易的降解壳聚糖，在2h内使得壳聚糖粘度下降到原来的7%，酶解最适条件是温度30～40℃、pH 5.0到6.0。纤维素酶解反应得到的米氏常数Km=9.4×10－2g/L，金属离子 Na+和 Fe2+对酶活性无影响，而 Zn2+、Mg2+、Cu2+、Li+、K+是酶的抑制剂，底物的脱乙酰度在80%～90%时酶解反应速度较快。周桂等［33］研究了纤维素酶降解壳聚糖的工艺条件，发现反应的最适温度50℃、pH 5.4。刘靖等［34］研究发现纤维素酶可以有效降解壳聚糖，它的最适温度为60℃，最适pH5.2，酶解反应米氏常数为 Km=10mg/mL，酶的激活剂是Mn2+、Mg2+和Ca2+，抑制剂是Ag+、Cu2+和Hg2+，最适作用的底物为脱乙酰度为90%的壳聚糖。刘羿君等［35］研究了特种纤维素酶催化水解壳聚糖，发现其最佳水解条件是温度58℃，pH5.3，反应时间3h，底物浓度为1%。孙婷等［36］用纤维素酶酶液和粗酶粉对壳聚糖进行降解，发现该酶降解壳聚糖的最适条件为温度50℃、pH 5.0、加酶量8U/g、底物浓度3%。

另外，人们对纤维素酶降解壳聚糖的最适底物和酶解产物也进行了研究。Muraki等［37］用纤维素酶降解壳聚糖得到聚合度在10以内的低聚壳聚糖占酶解产物70%以上，其中具有生理活性的占一半左右。刘靖等［30］研究表明，在纤维素酶降解壳聚糖的反应开始的15min内，底物粘度迅速下降一半，该酶的最适作用底物为脱乙酰度90%的壳聚糖，并且它能水解氨基葡糖之间和乙酰氨基与氨基葡糖之间的糖苷键。孙婷等［36］用纤维素酶降解脱乙酰度96%的壳聚糖，发现酶解反应在特定条件下进行20h后能得到聚合度为4的低聚壳聚糖，这证明了纤维素酶以内切方式降解壳聚糖。

由此可见，纤维素酶降解壳聚糖最适条件是温度30～60℃、pH5.5，Cu2+和Hg2+是酶的抑制剂，酶解最适底物是脱乙酰度85%的壳聚糖。除了纤维素酶降解壳聚糖最适pH偏高和酶解产物分子量分布范围比较广［38］之外，纤维素酶和壳聚糖酶降解壳聚糖的其他条件也很相似，且它们一般都以内切方式断裂β－1，4糖苷键，降低壳聚糖聚合度。纤维素酶降解壳聚糖，成本低廉，酶解反应容易操作，适合工业化生产。

2.3 脂肪酶

脂肪酶(Lipase)是一种催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的酶。然而，脂肪酶对壳聚糖的降解表现出十分强的活性，这使得专家们对脂肪酶降解壳聚糖的最佳条件、最适底物和酶解产物等方面进行了研究。

周孙英［39］等用猪胰腺脂肪酶降解壳聚糖分子链中β－1，4糖苷键。结果表明，猪胰来源的脂肪酶在温度40℃到50℃、pH在3左右，降解壳聚糖2h后，底物粘度下降了93%。马如等［40］用猪胰脂肪酶降解壳聚糖发现其最适条件为温度55℃、pH=5.0、反应时间2h。王丽娟等［41］研究了脂肪酶降解壳聚糖的反应条件，发现其最适水解条件为温度50～55℃、pH为5～5.5、反应时间3～4h，酶解反应不符合米氏方程，酶的激活剂是3mmol/L的Cu2+、10mmol/L的Mg2+和Ca2+、10mmol/L的Ba2+，Zn2+和Fe3+对该酶有一定的抑制作用。张洪威等［42］对脂肪酶降解壳聚糖最佳工艺进行研究，发现其水解壳聚糖最佳条件是在温度55℃、加酶量700U/g，降解壳聚糖2h。

Muzzarelli［43］等人对麦胚脂肪酶降解壳聚糖进行了研究，发现麦胚脂肪酶能够有效降解壳聚糖，但是得到产物的聚合度较广，反应结束后底物的粘度下降了65%，并且发现N－羧甲基化的壳聚糖表现出对酶更高的活性。Shin［44］等人研究发现日本根霉产的脂肪酶能对水溶性壳聚糖进行降解，水解产物分子量在30～50ku之间且能溶于pH呈中性的水中。周孙英［39］等用猪胰腺脂肪酶降解壳聚糖发现脱乙酰度在70%到90%之间的底物降解速度最快。李冬霞［45］从四种商品脂肪酶中筛选出具有较强水解壳聚糖能力的酶Aspergillus Oryzae，并且对这种酶做了详细的研究，发现脂肪酶的最适作用底物为脱乙酰度73%和82%的壳聚糖，生成的产物是聚合度2到6的低聚物，纯化后的脂肪酶对脱乙酰度为73%、81%和82%的壳聚糖都有很强的活性。

由此可见，不同来源的脂肪酶降解壳聚糖的最佳条件相似即温度在50℃左右、pH3～6，它的最适底物是脱乙酰度80%的壳聚糖。脂肪酶现在已经能够进行工业化生产，成本比较低，且对壳聚糖活性较高。因此，从商品脂肪酶中选择具有较高水解壳聚糖活性的酶来大量生产低聚壳聚糖的前景十分广阔。

2.4 蛋白酶

蛋白酶是指能够将蛋白质水解成氨基酸或多肽的酶。近年来，人们发现蛋白酶对壳聚糖具有较高的降解能力，它成为研究酶法降解壳聚糖的一个新热点。

陈云等人［46］研究了中性蛋白酶降解壳聚糖的工艺条件，发现以壳聚糖为底物的酶最适温度为50℃、pH 6.0，米氏常数 Km=1.1×10－2g/mL，抑制剂是Cu2+，Ba2+，Mn2+离子。黄永春等［47］人实验发现木瓜蛋白酶降解壳聚糖的最佳条件是温度45℃和pH 4.5，降解过程符合米氏方程。李和生等［48］对木瓜蛋白酶的水解工艺进行了研究，发现它降解壳聚糖的最佳工艺条件是温度45℃、pH 4.0、底物浓度1%、底物与酶的比例为25∶1(w/w)并且酶对脱乙酰度70%的底物有比较高的活性。该酶在最适条件下水解壳聚糖约60min，得到的产物平均分子量在一万以内，壳聚糖的起始降解速率很快，20min后粘度变化趋于平稳，60min后基本维持在93%～94%。

研究者们除了对蛋白酶降解壳聚糖的酶解工艺进行研究，还对蛋白酶的作用方式进行了探讨。Terboj－evich［49］等实验发现木瓜蛋白酶能很快降解壳聚糖且主要是断裂壳聚糖内部的氨基葡糖与N－乙酰氨基葡糖之间的糖苷键。陈云［50］等人研究了胃蛋白酶水解壳聚糖的最适条件，发现随着壳聚糖脱乙酰化度的提高胃蛋白酶活性降低，他们认为胃蛋白酶降解壳聚糖时要求β－1，4糖苷键的一端是N－乙酰氨基葡糖残基。苏畅［51］等人研究发现木瓜蛋白酶能断裂氨基葡糖与N－乙酰氨基葡糖之间和两个氨基葡糖之间的糖苷键。

总之，蛋白酶降解壳聚糖最佳条件是温度40℃到50℃、pH为4.0～6.0，它的最适底物是脱乙酰度70%的壳聚糖且酶解过程符合米氏方程。蛋白酶对壳聚糖的活性较高、它的价格低廉且已经成为商品酶，因此用蛋白酶降解壳聚糖是近些年来发现的一个制备低聚壳聚糖的新方法。然而，我们还需要进一步弄清楚蛋白酶水解壳聚糖的反应过程和机理等基础性问题以实现蛋白酶工业化生产低聚壳聚糖的目的。

2.5 非专一性酶降解壳聚糖机理

非专一性酶降解壳聚糖的机理，现在国内外专家还没有定论。有一种解释是这些非专一性酶如蛋白酶和脂肪酶中含有一些专一性很强的壳聚糖酶，但是Pantaleone［24］认为这种理论无法解释为何非专一性酶降解壳聚糖的活性强于专一性酶，并且实验中占非专一性酶数量四分之一的酶不具有或具有较低降解壳聚糖的能力。此外，从酶的催化作用以及它的来源看出每种酶又并不存在共同的活性中心，有的学者认为壳聚糖分子链上的羟基是非专一性酶降解壳聚糖的关键所在。文献中［52－54］有一种方法可以将低聚壳聚糖合成高聚壳聚糖即糖基转移法，Nocardia orientalis IFO1280菌株合成的甲壳素酶在一定条件下能将N－乙酰氨基葡糖四聚和五聚体催化生成七聚体，这可能是因为糖链中的羟基与氨基在溶液中通过某种方式对非专一性酶的催化基团起作用，如果这个反应可以逆向进行，那么这对于研究壳聚糖降解机理有很大帮助。

非专一性酶对壳聚糖的降解过程复杂，其降解原理并不清楚。但是与非专一性酶相比，壳聚糖酶价格十分昂贵，它对壳聚糖的活性要比一些非专一性酶低一些［25］。因此，加强对非专一性酶降解壳聚糖反应原理的研究和发明一种应用该种酶工业化生产功能性低聚壳聚糖的技术将成为国内外的研究趋势。

3 酶法降解壳聚糖产物的应用

酶法降解壳聚糖生成的产物是低聚壳聚糖，它在食品、生物医药和化妆品等方面有着广泛的应用。

3.1 低聚壳聚糖在食品上的应用

低聚壳聚糖是天然阳离子型大分子物质，它具有抑菌、絮凝沉降、降低血糖和瘦身保健等多种对人体有益的功能，被广泛用于食品中［55］。

3.1.1 抑菌剂 低聚壳聚糖具有一定的杀菌和抑菌作用。吴小勇等［56］发现不同脱乙酰度和不同分子质量的低聚壳聚糖都有抑菌作用，在pH为5.5～6.0的条件下壳聚糖具有最强的抑菌活性，在实验条件下低聚壳聚糖的抑菌活性高于苯甲酸钠。于艳敏等［57］研究发现，酶解制备的低聚壳聚糖对抗药性的大肠杆菌有很好的抑制效果，最低抑菌浓度为0.05%，酶解产物浓度2.5%时抑菌圈直径可达18.6mm。这可能是因为低聚壳聚糖在细胞表面形成一层阻止营养物质进入细胞的膜，或者它进入细胞和细胞质内的离子形成络合物干扰细胞代谢从而起到抑菌作用［58］。研究表明［59］，在酱油中添加一定量的低聚壳聚糖可以抑制腐败菌的生长，抑制效果强于苯甲酸钠并对酱油的色泽和香味影响很小。因此，将低聚壳聚糖制成抑菌剂加入到食品中可以起到延长食品保质期的作用。

3.1.2 果蔬保鲜剂 影响果蔬保存的因素主要有致病微生物侵染、果蔬的水分蒸发以及呼吸作用，低聚壳聚糖不仅具有良好的抑菌能力而且也有保湿、增湿和抑制果蔬呼吸的作用。邵健等［60］研究表明，低聚壳聚糖具有良好的吸湿和保湿功能即使在相对湿度为42%的环境中仍然不释放其中的水，只有在硅胶干燥器这种相对湿度很小的环境中低聚壳聚糖才放出吸收的水，这可能是因为它涂在水果表面时会形成一层薄膜，它的极性基团会与空气中的水分子形成氢键以保持水果表面湿润。水茂兴等［61］通过实验发现不同分子量的低聚壳聚糖混合配成的保鲜液能够将青椒和番茄在常温下贮藏时间长达15d，这可能是因为低聚壳聚糖在果蔬表面会形成低O2高CO2的环境，抑制其呼吸作用，使果蔬保持新鲜。

3.1.3 澄清除杂剂 低聚壳聚糖是带有阳离子的大分子物质，它对蛋白质、核酸和果胶等有非常好的絮凝和沉降作用，可以用于果汁、酒和醋等液体的澄清以除去杂质。何志刚等［62］通过实验发现，用低聚壳聚糖澄清杨梅果酒具有速度快、酒体稳定和对果酒内的营养成分影响小的优点，澄清度能达到91.4%。梁茂雨等［63］用低聚壳聚糖澄清西番莲果汁，果汁的透光率达91.13%且营养的损失率较低。于淑兰［64］应用低聚壳聚糖澄清姜汁，姜汁的透光率达98%。由此可见，低聚壳聚糖是很好的澄清除杂剂。

3.1.4 降血糖剂 近年来，很多研究者发现低聚壳聚糖有良好的降血糖功效，并且它是天然化合物，对人体无毒副作用。尤行宏等［65］用低聚壳聚糖对糖尿病大鼠进行实验，发现低聚壳聚糖可以明显降低其血糖浓度，使血液中胰岛素含量升高(P＜0.01)并能维持体重(P＜0.01)，但是低聚壳聚糖对正常大鼠的血糖和血液中胰岛素含量没有影响。孙萍等［66］研究发现水溶性低聚壳聚糖能够明显降低糖尿病小鼠的血糖含量(P＜0.05)，使其肝糖原含量增加明显(P＜0.01)，而对正常小鼠的血糖无影响。韩永萍等［67］经实验发现，由酶法制备的低聚壳聚糖有很高的降血糖活性(P＜0.01)，甚至优于降糖作用很好的拜糖苹，并同时起到保肝护肾的功效。低聚壳聚糖降血糖的原因可能是在生物体血糖含量异常时，它刺激胰岛细胞增加胰岛素分泌、促进肝糖原合成和调节葡萄糖在动物小肠内的吸收从而起到降血糖的作用［65－66］。因此，添加了低聚壳聚糖的食品对血糖偏高的人群有很好的保健作用。

3.1.5 降脂瘦身剂 随着人们生活水平的提高，降脂瘦身成为人们的需求之一，低聚壳聚糖近年来展现出良好的降脂活性，受到专家们的关注。翁娜等［68］研究发现，水溶性低聚壳聚糖能明显降低高血脂小白鼠血液中总胆固醇、甘油三酯水平和丙二醛含量，降幅分别达到28%、30%和40%。李玲等人［69］发现低聚壳聚糖和壳聚糖能够明显降低高血脂大鼠的血清总胆固醇和甘油三酯(P＜0.01)，并使得血清高密度脂蛋白胆固醇升高(P＜0.05)。覃容贵等［70］用低聚壳聚糖喂养高血脂大鼠8周，发现低聚壳聚糖能显著降低血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量(P＜0.01)，明显升高血清高密度脂蛋白胆固醇的含量(P＜0.01)和降低大鼠的体重(P＜0.01)。低聚壳聚糖降脂机理目前还没有定论，可能是由于它在胃中能形成凝胶吸附脂肪和胆固醇，降低血清总胆固醇和甘油三酯的含量，并且分子量较低的低聚壳聚糖可以进入细胞中发挥降血脂功能［68－70］。因此，将低聚壳聚糖添加到食品中将对血脂偏高人群有良好的降脂保健的作用。

3.2 低聚壳聚糖在生物医药上的应用

低聚壳聚糖是天然大分子物质并有着较强的水溶性、生物活性和生物相容性，这使得它在生物医药上的用途广泛。吕中明等［71］对低聚壳聚糖免疫调节作用进行了研究，发现低聚壳聚糖能增强小鼠血清溶血素反应和巨噬细胞功能(P＜0.01)。杜昱光等［72］研究发现，低聚壳聚糖对癌细胞有较强的抑制作用，对S180癌细胞DNA抑制率可达98.5%;对肝癌细胞的抑制率可达76%，他们还发现低聚壳聚糖在胃内可以保护和修复损伤部位，抵抗胃酸抑制胃溃疡的形成［73］。此外，低聚壳聚糖多用于与人体直接接触的人造皮肤、手术缝合线、人工透析膜、医用纱布等多种医用材料中，还可以制成蛋白质或多肽类药物载体，保护药物不被人体内的蛋白酶降解，提高药物的利用率［74－75］。

3.3 低聚壳聚糖在化妆品中的应用

低聚壳聚糖应用到化妆品中主要是由于它良好的保湿增湿的特性［60］。研究者将低聚壳聚糖复配到护肤化妆品中既可以防止化妆品中水分流失又可以锁住皮肤表面水分并且能保持皮肤弹性，不会阻碍废物和毒素从皮肤表面排出，日本开发出添加有低聚壳聚糖的油包水化妆品，他们在37℃用酶降解壳聚糖8h得到的低聚壳聚糖复配到化妆品中，添加量约为5%，发现这种化妆品较以前具有更好的柔软性和保湿性［76］。另外，低聚壳聚糖添加到化妆品中除了能保湿增湿，还能有效地抑制微生物的滋生［56－57］和清除人体内活泼氧自由基，起到抗衰老的作用。尹学琼等［77］研究发现，低聚壳聚糖对超氧自由基有较强的清除能力，浓度为0.5×10－2g/mL时，清除率可达98.2%，且其对猪油的抗氧化能力和VE、叔丁基对苯二酚相近。陈燕青等［78］研究发现，由壳聚糖制备的水溶性低聚壳聚糖对超氧自由基清除率可达75.61%。姚倩等［79］对低聚壳聚糖抗氧化性进行了研究，发现低聚壳聚糖对羟自由基和DPPH自由基有较强的清除和还原能力，在浓度为10mg/mL时低聚壳聚糖对羟自由基清除率可达85.5%，而未降解的壳聚糖衍生物在相同浓度下的清除率为6.9%。孙涛等［80］对低聚壳聚糖衍生物的抗氧化性作了研究，发现它对超氧阴离子的半抑制浓度为8.40mg/mL，对羟自由基的半抑制浓度为0.440mg/mL。研究表明［78］，低聚壳聚糖的活性氨基和羟基决定了它的抗氧化能力大小，聚合度越低的壳聚糖越能暴露出更多的活性氨基和羟基，因而具有更好的抗氧化活性。

总之，壳聚糖的酶解产物被广泛的应用到食品、医药和化妆品中，已经和人们的生活密切相关。随着人们对酶法降解壳聚糖研究的不断深入，人们会发现更多种类的具有生理活性的低聚壳聚糖并且会不断增强其生理活性，使得低聚壳聚糖应用的范围变得更广。

4 结论

近些年来，人们发现酶法降解壳聚糖产生的低聚壳聚糖产物具有多种生理活性，这使得低聚壳聚糖在如化妆品、食品和生物医药等领域得到了广泛的应用［2－4］，并且壳聚糖的酶法降解及其产物的应用已经成为国内外研究的热点之一。国内外专家对专一性酶和非专一性酶降解壳聚糖最适条件以及产物的研究都比较深入，但是对酶解反应原理尤其是非专一性酶的作用原理的研究很少，很多的酶解反应机制并不清楚。这就使得酶解法制备壳聚糖大都处在实验室阶段而并没有应用于工业化生产。因此我们还需要对以下几个方面进行更加深入的研究来实现酶法制备壳聚糖的工业化。

首先，应用物理化学手段对底物或酶进行处理以了解壳聚糖的酶解机理。我们可以应用物理法将壳聚糖分子做某种形式的处理，再通过酶解来得到低聚壳聚糖，分析产物的聚合度来分析酶的作用方式;也可以通过化学手段修饰酶分子或底物分子来促进或抑制产物得率，间接反映酶解的作用机理。用物理法预处理底物时可能会使低聚壳聚糖的产量增加，提高其经济效益。其次，我们可以用一种已知酶解机理的酶A与未知机理的酶B共同降解底物，通过复合酶与单一酶A在相同条件下降解壳聚糖产物的不同来推测酶B的酶解机理。另外，通过外加装置可以实现生物酶降解壳聚糖反应和产物分离同时进行，这有利于实时分析酶解产物的聚合度。但要注意酶解反应的过程中需要不断将产物分离出去以使得反应正向进行。

目前，酶解壳聚糖反应原理是国内外研究的热点。随着科技的进步，酶促反应的相关理论将会更加成熟，各种新的酶解壳聚糖工艺将会出现。具有多种生理活性的低聚壳聚糖将会在食品、生物医药和化妆品中发挥更大的作用。

［1］蒋挺大.甲壳素［M］.第一版.北京:化学工业出版社，2003:7－18.

［2］蒋挺大.壳聚糖［M］.北京:化学工业出版社，2001:9－10.

［3］韩永萍，林强.低聚壳聚糖制备及其生理活性进展［J］.化学工业与工程，2007，24(3):272－276.

［4］魏新林，夏文水.甲壳低聚糖的生理活性研究进展［J］.中国药理学通报，2003，19(6):614－617.

［5］李红，高德玉，李锦书，等.壳聚糖降解技术［J］.化学工程师，2008，22(3):27－29.

［6］陈巍，罗志刚，李忠彦，等.物理方法在壳聚糖降解中的应用［J］.中国甜菜糖业，2006(3):24－28.

［7］Monaghan R L，Eveleigh D E，Tewari F P，et al.Chitosanase，a novel enzyme［J］.Nature New Biol，1973，245:78－80.

［8］方祥年，杜昱光，等.球孢白僵菌胞外壳聚糖酶的纯化和性质［J］.菌物系统，2002，21(1):77－83.

［9］葛正红，曾嘉.青霉菌产壳聚糖糖酶的分离纯化及性质研究［J］.中国医药工业，2002，33(8):378－381.

［10］郑连英，随斯光.产壳聚糖酶菌株的诱变育种及其产酶条件研究［J］.浙江大学学报:工学版，2004，38(8):1039－1042.

［11］王艳，周培根，俞剑，等.假单胞菌产壳聚糖酶突变菌株的筛选［J］.中国海洋药物杂志，2004，23(5):38－40.

［12］王平平，周培根，王艳，等.细菌产壳聚糖酶的性质初探［J］.上海水产大学学报，2003，12(4):380－383.

［13］叶淑红，万惠萍，丁鸣，等.细菌BK2产壳聚糖酶的发酵条件及壳寡糖的制备［J］.大连轻工业学院学报，2007，26(4): 310－312.

［14］李风平，何潇，鲍晓明.壳聚糖酶产生菌的筛选及其酶解产物的初步研究［J］.山东大学学报，2003，38(1):96－98.

［15］方文建，隋斯光，郑连英.青霉菌产壳聚糖酶制备低分子量壳聚糖的研究［J］.中国医药工业杂志，2006，37(2):85－88.

［16］Fenton D，Davis B，Rotgers C，et al，Purification and mode of action of a chitosanase from Penicillium islandium［J］.J Gen Microbiol，1981，126:151－165.

［17］Takiguchi Y，Shimahara K.Isolation and identification of a thermophilic bacterium producing N，N’－diacetylchitobiose from chitin［J］.Agric BiolChem，1989，53:1537－1541.

［18］Izume M，Nagae S，Kawagishi H，et al.Action pattern of Bacillus sp.No.7－M chitosanase on partially N－acetylated chitosan.Biosci［J］.Biosci Biotech Biochem，1992，56(8):448－453.

［19］Hutadilok N，Mochimasu T，et al.The effect of N－substitution on the hydrolysis of chitosan by an endo－chitosanase［J］.Carbo Res，1995，268:143.

［20］陈小娥.曲霉产壳聚糖酶酶学性质及作用机理研究［D］.无锡市青山湾:江南大学，2004:85－89.

［21］Uchida，Y Ohtakara A.Chitasanase from Bacillus species［J］.Meth Enzymol，1988，161.

［22］Fukamizo T，Honda Y，Goto S，et al.Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp.N174.［J］.J Biochem，1995，311:373－383.

［23］吴绵斌，夏黎明，岑沛霖.壳聚糖酶解的随机进攻动力学模型［J］.高校化学工程学报，2001，15(6):552－556.

［24］Pantaleone D，Yalpani M，Schollar M.Unusual susceptibility of chitosan to enzymic hydrolysis［J］.Carbohyd Res，1992，237: 325－332.

［25］Yalpani M，Pantaleone D.An examination of the unusual susceptibilities of aminoglycansto enzymatic hydrolysis［J］. Carbohyd Res，1994，256:159－175.

［26］周孙英，余萍，陈盛.溶菌酶对壳聚糖降解的研究［J］.中国海洋药物，2002(6):25－28.

［27］马如，黄明智.壳聚糖的溶菌酶降解［J］.北京化工大学学报，2002，29(6):40－43.

［28］张立彦，曾庆孝，李作为.溶菌酶降解壳聚糖条件的研究［J］.功能高分子学报，2004，17(3):391－395.

［29］Nishimura S，Nishi N，Tokura S.Bioactive chitin derivatives. Activation of Mouse－ peritoneal macrophages by O －(Carboxymethyl)－chitins［J］.Carbohyde Res，1986，146:251－258.

［30］Ishiguro K，Yoshie N，Sakurai M.A 1H NMR study of a fragment of partially N－deacetylated chitin produced by lysozyme degradation［J］.Carbohydr Res，1992，237:333－338.

［31］Kjell M Varum，et al.In vitro degradation rates of partially N－acetylated chitosans in human serum［J］.Carbohydr Res，1997，299:99－101.

［32］周孙英，陈盛，余萍.纤维素酶降解壳聚糖的研究［J］.福建师范大学学报，2002，18(4):64－68.

［33］周桂，何子平，邓光辉，等.纤维素酶与淀粉酶降解壳聚糖的动力学研究［J］.海洋科学，2003，27(11):59－67.

［34］刘靖，夏文水.纤维素酶水解壳聚糖的特性研究［J］.食品工业科技，2005，26(12):157－160.

［35］刘羿君，蒋英，封云芳，等.特种纤维素酶催化水解壳聚糖及壳寡糖的制备研究［J］.功能高分子学报，2005，18(2): 325－328.

［36］孙婷，余晓斌，李淑瑞.纤维素酶水解壳聚糖条件的研究［J］.中国酿造，2009，209(8):34－37.

［37］Muraki E，Yaku F，Kojima H.Preparation and crystallization of D－Glucosamine oligosaccharides with DP 6－8［J］.Carbohydr Res，1993，239:227－237.

［38］TerayamaH，TakahashiS，KuzuharaH.ChemInform Abstract:Large－Scale Preparation of N，N＇－Diacetylchitobiose by Enzymic Degradation of Chitin and Its Chemical Modifications［J］.J Carbohydr Chem，1993，12(1):81－93.

［39］周孙英，余萍，陈盛，等.脂肪酶催化壳聚糖降解的特性［J］.福建医科大学学报，2002，36(3):302－305.

［40］马如，黄明智.脂肪酶降解壳聚糖的反应动力学研究［J］.化学世界，2002，43(9):472－475.

［41］王丽娟，夏文水，陈小娥，等.脂肪酶水解壳聚糖作用研究［J］.食品工业科技，2004，25(5):51－53.

［42］张洪威，朱玲，苑望，等.脂肪酶法降解壳聚糖的研究［J］.哈尔滨师范大学:自然科学学报，2009，25(1):64－66

［43］Muzzarelli R A A，Xia W S［J］.Enzyme and Microbial Technology，1995，17:541－545.

［44］Shin S S，Lee Y C，Lee C.The degradation of chitosan with the aid of lipase from Rhizopus japonicus for the production of soluble chitosan［J］.J Food Biochem，2001，25:307－321.

［45］李冬霞.商品脂肪酶降解壳聚糖机理研究［D］.江南大学，2008.

［46］陈云，刘立军.中性蛋白酶对壳聚糖的降解［J］.功能高分子学报，1999，12(3):293－296.

［47］黄永春，李琳，郭祀远，等.木瓜蛋白酶降解壳聚糖动力学研究［J］.食品科学，2003，24(4):34－38.

［48］李和生，孙玉喜，吴汉民，等.木瓜蛋白酶水解壳聚糖的工艺研究［J］.天然研究产物与开发，2006，18(3):478－482.

［49］Terbojevich M，Cosani A，Muzzarelli R A A.Molecular parameters of chitosans depolymerized with the aid of papain［J］. Carbohyd Polym，1996，29(1):63－68.

［50］陈云，胡健，赵国骏，等.胃蛋白酶催化壳聚糖降解的特性研究［J］.扬州大学学报，2000，3(3):31－34.

［51］苏畅，夏文水，姚惠源.木瓜蛋白酶降解壳聚糖［J］.无锡轻工大学学报，2002，21(2):112－115.

［52］曾宪放，陈苏陵，李吉高.甲壳质和甲壳胺寡聚糖的制备［J］.中国海洋药物，1995(3):46－51.

［53］张虎，杜昱光，虞星炬.几丁寡糖制备与功能［C］.中国甲壳质资源研究开发应用学术研讨会论文集:上册，青岛:1997: 84－89.

［54］Maeda R，Omata M，Matsumoto M.et al.Preparation of chitooligosaccharides by transglycosylation using lysozyme［J］.Sci Eng Rev Doshisha Univ(Japanese)，1997，38(2):99－105.

［55］俞露，文九巴，陶建中.低聚壳聚糖的性质和应用研究［J］.河南科技学院学报，2009，37(4):43－46.

［56］吴小勇，曾庆孝，莫少芳，等.不同脱乙酰度和分子质量的壳聚糖的抑菌性能［J］.华南理工大学学报，2006，34(3): 58－62.

［57］于艳敏，毛胜刚，孙军德.壳聚糖酶解液对抗药性大肠杆菌的抑制作用［J］.沈阳农业大学学报，2007，38(3):422－424.

［58］阳元娥，罗发兴.壳聚糖及其衍生物在医药中的应用［J］.中国医药工业杂志，2002，33(8):408－411.

［59］乔世伟.酱油中添加壳低聚糖抑制酵母菌群生长的实验研究［J］.中国调味品，1998，12:16－17.

［60］邵健，杨宇民，姚成.低聚氨基葡萄糖的保湿、吸湿和抑菌性质［J］.中国海洋药物杂志，2000(4):25－27.

［61］水茂兴，马国瑞，陈美慈，等.壳聚糖处理番茄、青椒的保鲜效果［J］.浙江农业科学，2001(4):164－167.

［62］何志刚，李维新，林晓姿，等.壳聚糖澄清杨梅果酒的影响因素与效果评价［J］.农业工程学报，2006，22(8):199－202.

［63］梁茂雨，纵伟，赵光远.壳聚糖澄清西番莲果汁的研究［J］.安徽农业科学，2007，35(4):1113－1155.

［64］于淑兰.壳聚糖澄清姜汁工艺条件的研究［J］.中国调味品，2009，34(7):65－67.

［65］尤行宏，吴勇，李美平，等.低分子壳聚糖对实验性糖尿病大鼠血糖的调节作用［J］.湖北中医学院学报，2005，7(1): 18－20.

［66］孙萍，朱立华，杨桂文，等.水溶性壳聚糖的降血糖作用研究［J］.山东医药，2007，47(10):23－24.

［67］韩永萍，林强，张元.壳聚糖的复合法降解及降解产物降血糖活性的研究［J］.时珍国医国药，2009，20(9):2193－2195.

［68］翁娜，陈剑锋，张煜荣，等.水溶性壳聚糖的制备及其降血脂作用［J］.中国现代应用药学，2005，22(3):817－820.

［69］李玲，张家骊，刘静娜，等.壳聚糖降脂保肝作用的研究［J］.中国海洋药物，2007，26(2):7－9.

［70］覃容贵，吴建伟，国果，等.蝇蛆壳聚糖对高脂血症大鼠降脂作用［J］.中国公共卫生，2008，24(4):474－475.

［71］吕中明，石根勇，陈新霞，等.壳聚糖免疫调节作用的研究［J］.实用预防医学，2001，8(5):330－332.

［72］杜昱光，白雪芳，金宗濂，等.壳寡糖抑制肿瘤作用的研究［J］.中国海洋药物，2002，21(2):18－21.

［73］綦秀芬，刘桂菊，李思泽.甲壳质及其衍生物在医药方面的应用［J］.齐鲁医学杂志，2002，17(4):364－366.

［74］龙柏华，张滔，王科军.低聚壳聚糖的制备与应用研究［J］.江西化工，2006(4):34－37.

［75］郭巧玲.低聚壳聚糖的生理活性及应用［J］.漳州职业技术学院学报，2008，10(4):27－41.

［76］南伟，孙爱兰.壳聚糖及低聚壳聚糖在日用化妆品中的应用［J］.化工进展，2003，22(12):1304－1307.

［77］尹学琼，张岐，林强，等.低聚壳聚糖及其稀土(LaCl3· nH20)配合物的抗氧化活性研究［J］.食品科学，2002，23(2): 27－30.

［78］陈燕青，丁德润，邵烨，等.Dy(Ⅲ)与低聚壳聚糖配合物的制备与抗氧化活性研究［J］.上海工程技术大学学报，2005，19(4):306－313.

［79］姚倩，孙涛，徐轶霞.低聚壳聚糖衍生物的制备及其抗氧化性能［J］.天然产物研究与开发，2008，20(3):530－533.

［80］孙涛，巢骏，康永锋，等.C60－低聚壳聚糖衍生物抗氧化性的研究［J］.湖南农业科学，2009(9): 8－14.

The review of enzymatic hydrolysis of chitosan and its product application

DOU Shen，LIAO Yong－hong*，YANG Chun－xia，REN Wen－ya，XU Jin
(School of Food/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

Chitosan is a natural biological polysaccharide and it is originated from Chitin.After several steps of degradation，it shows excellent biological activity.Specific and non－specific enzymatic hydrolysis of chitosan and its product application were introduced，and several aspects about water－solubleoligo－chitosan manufacturing were showed.

chitosan;enzymatic of hydrolysis;water－solubleoligo－chitosan

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0537－07

2010－11－16 *通讯联系人

窦屾(1986－)，男，在读研究生，主要从事有关食品生物技术方面的研究。

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAC11B00)。