乌头类中药化学成分及其生物碱含量测定方法的研究概况

2011-08-15周玲

中国中医药现代远程教育 2011年2期

周玲

周玲

乌头类中药；生物碱；测定方法；中药鉴定；综述

乌头类中药材具有悠久的临床运用历史，包括附子、川乌、草乌等。中医认为乌头类药材有大热、大毒的药性。其中附子具有回阳救逆的功效，临床上多用于治疗阳虚阴盛；乌头具有祛风湿止痛的功效，临床多用于治疗风湿性关节炎。现代研究表明乌头类生物碱既是其有效成分，也是毒性成分[1]。因此不少学者对乌头类生物碱的种类和含量测定的方法进行了研究。

1 乌头类中药化学成分的研究概况

附子来源于毛茛科乌头属植物乌头 Aconrtum carmichaelii Debx.的侧生子根及加工品[1]，是众多乌头类中药中最常用的一类；川乌为毛茛科植物乌头Aconrtum carmichaelii Debx.的干燥母根；草乌为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根[2]。

附子、川乌及草乌中共同的化学成分有：双酯型生物碱，如乌头碱（Aconitine）、新乌头碱（Mesaconitine）、次乌头碱(Hypaconitine)；胺醇类生物碱，如尼奥灵(新乌宁碱，Neoline)、塔拉乌头胺（Talatizamine）；二萜类生物碱，如北乌碱（Beiwutine）、去氧乌头碱（Deoxyaconitine）。

从毒性角度来看，乌头类中药中的主要毒性成分为双酯型生物碱，单酯型生物碱和胺基醇型生物碱。其中双酯型生物碱的毒性最大，主要有乌头碱、新乌头碱和次乌头碱三种，属于难溶于水的脂溶性成分；单酯型生物碱是双酯型生物碱C8位上的乙酰基水解失去一分子乙酸后的产物。属于亲水性成分，毒性较小，为双酯型生物碱的 1/2 000；胺基醇型生物碱是酯型生物碱 C14位上苯甲酯酰基水解失去一分子苯甲酸后的产物，属强亲水性成分，毒性甚微，仅是双酯型生物碱的1/2 000～1/4 000。通常认为这三类生物碱既是乌头类中药的有效成分，也是它们的毒性成分[9]。

2 乌头总生物碱含量测定方法的研究概况

2.1 酸碱中和法原理：利用生物碱的碱性，用酸直接滴定或加入定量酸液及指示剂，用氢氧化钠液回滴定，根据消耗碱液的体积计算出乌头类总生物碱的含量。1990年版、1995年版、2000年版、2005年版、2010年版《中国药典》一部中对制川乌、制草乌中乌头类总生物碱的含量测定均采用此方法。

方法：取本品中粉10g，精密称定，加乙醚-三氯甲烷（3:1）的混合液50ml与氨试液4ml，密塞，摇匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚-三氯甲烷 50ml，连续振摇1h，滤过，药渣用乙醚-三氯甲烷洗涤3～4次，每次15ml，滤过，洗液与滤液合并，低温蒸干。残渣加乙醇 50ml使溶解，精密加入硫酸滴定液（0.01mol/L）15ml，水15ml与甲基红指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）滴定至黄色。每 1ml硫酸滴定液（0.01mol/L）相当于12.9mg的乌头碱[1]。

有学者采用此方法测定了川乌、附子及炮制品中生物碱的含量[9]，还测定了制剂三七伤药片[10]、小活络丸[11]中的总生物碱的含量。此方法的优点是简单易行，不需要很昂贵的仪器设备，容易普及；缺点是操作方法比较麻烦，如果操作的平行性不好，会使误差较大。

2.2 分光光度法

2.2.1 酸性染料比色法原理：利用生物碱和酸性染料（如溴甲酚氯）反应生成的络合物在紫外光下有吸收，用乌头碱的标准液绘制标准曲线后，根据标准曲线法计算乌头类生物碱的含量。利用酸性染料比色法测定生物碱总量时，要注意符合比尔定律的含量范围，水相 pH的选择要与文献中的一致。

方法：精密量取乌头碱标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分别置于分液漏斗中，加入三氯甲烷20ml，以第一份为空白对照，然后各加入10mlpH=6.0的溴甲酚绿染料，充分振摇，静置1h，三氯甲烷层置于25ml量瓶中并用三氯甲烷稀释至刻度。于415nm波长处，测定吸光度。以生物碱量与吸光度为横纵坐标，绘制标准曲线。再用同样方法在同样条件下测定样品溶液的吸光度，最后根据标准曲线法计算出乌头碱的含量[12]。

乌兰娜日等选择溴甲酚绿为酸性染料，以乌头碱（10mg/100ml，氯仿）作对照，于波长（415±1）nm 处测定附子理中丸中乌头总碱含量。平均回收率为99.5%，RSD为1.43%。王海孙等[13]选择文献的条件测定风湿骨痛酒中乌头总生物碱含量,平均回收率为 98.58%，RSD为1.83%。此方法的优点是灵敏度高、简便、准确快速。缺点是干扰因素多，水相 pH值或指示剂配制、处理均影响呈色稳定性，颜色稳定时间较短，需用对照品绘制标准曲线，且专属性差。

2.2.2 导数分光光度法原理：利用设定不同的求导阶数以清除干扰组分的吸收，直接进行测定生物碱的含量。根据导数分光光度法，样品经乙醇提取后，不经分离即可直接测定，测定结果与药典法比较,无显著差别。

龙沛霞等[14]将制草乌，制川乌，附子在碱性条件下用乙醇提取生物碱，不经分离，直接采用一阶导数紫外分光光度法测定总生物碱的含量，操作简便。徐思文采用二阶导数光谱法测定三七伤药片中总生物碱含量，样品和标准品溶液在波长（238±2）nm 和（246±2）nm 处有相应的吸收谷和吸收峰，而阴性对照光谱呈近平行线，不干扰样品中乌头总生物碱的定量分析。所以选择此两波长谷峰之间的导数振幅值作为三七伤药片中总生物碱的定量依据。此法的优点是灵敏度很高、准确、简便，且提取溶剂乙醇比氯仿对人体更安全。缺点是选择性差，达不到对双酯型乌头碱限量控制的要求。

2.3 薄层扫描法

2.3.1 高效硅胶 G 板-薄层色谱李焕荣等选择高效硅胶 G板，以氯仿-醋酸乙酯-氨水（15:20:1）为展开剂展开，喷以碘化铋钾显色后，双波长锯齿形反射扫描测定镇痛宁注射液中乌头总碱含量，平均回收率为97.85%，RSD为1.98%。

2.3.2 硅胶G板-薄层色谱王浴铭等选择硅胶G板，以正己烷（氨水饱和）-乙酸乙酯-95%乙醇（64:36:10）为展开剂展开，碘蒸气显色后，双波长锯齿形反射扫描测定活血壮筋丹中乌头总碱含量。平均回收率为95.75%，RSD为0.824%。

薄层扫描法准确度高，专属性强，重现性好，适用于不能用酸碱中和法进行含量测定的复方制剂。

2.4 高效液相色谱法（HPLC）邹恩济等采用反高效液相色谱法，以甲萘基为内标，分离测定两种蒙成药那如-3、嘎日迪-5中草乌的3种剧毒性成分，选择色谱柱为150mm×416mm id 的不锈钢柱；流动相甲醇-水-氯仿-三乙醇（70:30:20:11），检测波长230nm。平均回收率：新乌头碱9817%，RSD=2.1%；乌头碱93.65%，RSD 为1.1%；次乌头碱101.7%，RSD = 3.2%。

现行2010年版《中国药典》中采用的高效液相色谱法可以同时测定含乌头碱的复方制剂中六个组分，包括单酯型和双酯型生物碱[2]。

用HPLC 测定中乌头碱的含量，操作简便，样品用量少，杂质分离效果好，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱均达到了基线分离，回收率、重现性、精密度均很好。

3 总结

现在测定乌头总生物碱或者是测定酯型生物碱的含量有许多方法，但要根据条件进行灵活的选择。酸碱中和法适用于川乌、草乌、附子单味药材乌头生物碱含量测定，不适合用于测定含有其他碱性成分的复方制剂；紫外分光光度法一般只能测定乌头生物碱总量；薄层扫描法不仅可用于单味药材川乌、草乌、附子中乌头碱的含量测定，还广泛应用于含有川乌的复方中药制剂中酯型生物碱含量测定；高效液相色谱法可分别测定乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的含量，且操作简便，结果准确、重现性好，是目前复方中药制剂中乌头类生物碱含量测定的首选方法。

[1] 李娅萍,田颂九,王国荣.乌头类药物的化学成分及分析方法概况[J].中国中药杂志,2001,26(10):659-660.

[2] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典 2010年版(一部) [M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[3] 张卫东,韩公羽,梁华清,等.国内外对中药附子成分与活性的研究[J].药学实践,1996,14(2):91-95.

[4] 王宪楷,张同芳.中坝附子及其化学成分[J].中国药学杂志,1993,28(11):690.

[5] 张卫东,韩公羽.四川江油附子生物碱成分的研究[J].药学学报,1992,27(9):670-673.

[6] 李正邦,吕光华,陈东林,等.草乌中生物碱的化学研究[J].天然产物研究与开发,1997,9(1):9～10.

[7] 孙玉军,陈彦,吴佳静,等.草乌多糖的分离纯化和组成性质研究[J].中国药学杂志,2000,35(11):731-732.

[8] 周静波.附子配伍甘草、大黄、干姜调控药性物质基础研究[J].成都中医药大学博士学位论文,2009.

[9] 贝自英.酸碱中和法测定川乌、附子及炮制品中生物碱的含量[J].南京中医学院学报,1984,(3):49.

[10] 陆履雯.三七伤药片中生物碱含量测定[J].中成药研究,1983,(1):19.

[11] 颜根宝,胥法领,金凤珠.小活络丸中乌头总碱的分析[J].中成药,1989,11(3):14.

[12] 张国红,由会玲,刘云肖.乌头生物碱含量测定方法现况[J].河北中医药学报,2000,15(1):45-47.