心脏T型钙离子通道

Erlinda The，Muktanand Vikash Jhummon，魏毅东

心肌细胞膜存在两种不同的Ca2+通道(L型和T型)。1953年Fatt和Katz首次发现电压依赖性Ca2+内流这种重要生理特征［1］，1975年Hagiwara等人经研究又进一步证实［2］。心脏电压依赖性Ca2+通道被认为与细胞膜去极化过程中调控Ca2+内流和参与细胞的兴奋、收缩、激素分泌及相关基因转录相关。20世纪80年代，在心肌细胞中第一次记录到两种不同的Ca2+通道:L型和T型Ca2+通道。对比需较高电压才能激活且通道开放持久的L型Ca2+通道，T型Ca2+通道以低电压激活为特点，属于瞬间类型离子通道［3-4］。心脏中L型Ca2+通道表达丰富，并肩负Ca2+进入细胞的重任，最终触发心肌细胞的收缩。T型Ca2+通道由于其小振幅和瞬间性的特点最初被认为在心肌细胞电学活动中充当了小角色［5-6］。然而，在20世纪90年代T型Ca2+通道阻断剂的发现和成功克隆出三个T型Ca2+通道异构体(CaV3.1、CaV3.2和CaV3.3)显著促进了对T型Ca2+通道的研究［7-8］。

1 T型Ca2+通道的分子基础

电压依赖性Ca2+通道从电生理方面分为两大类:低电压激活和高电压激活Ca2+通道。根据电压依赖性Ca2+通道药理和生物特性，又分为5组(P/Q、N、L、R和T)。低电压激活通道只有T型Ca2+通道，它在低的细胞膜电位通道开放，通道失活也非常迅速［9-10］。L型和T型Ca2+通道在心肌细胞中均存在。L型 Ca2+通道已发现有4个亚基(α1、γ、β、和α2δ)，而在 T 型 Ca2+通道只有 α1 亚基被证实［8］。α1 亚基是孔型亚基，它决定了通道的大多数特性，如通道对Ca2+的选择性，通道激活对电压的依赖性和对Ca2+通道阻断剂的敏感性。有10个基因编码孔状的α1亚基，CaV1.2(α1C)和CaV1.3(α1D)为 L 型 Ca2+通道，CaV3.1(α1G)、CaV3.2(α1H)和CaV3.3(α1I)为T型Ca2+通道。心脏中T型 Ca2+通道主要表达类型为CaV3.1和CaV3.2，也有报道称CaV3.3在浦肯野纤维中有少量表达［8，10-12］。经相关电生理研究表明经重组表达的CaV3.1和CaV3.2通道电流与心肌本身T型Ca2+电流(ICa，T)类似。虽然 CaV3.1 和 CaV3.2 有类似的激活和失活的特性，但是它们从失活状态中的恢复仍有区别，被镍阻断的敏感性也有不同。CaV3.2电流可在相对低浓度的镍中阻断(IC50=13 μM)，而CaV3.1电流对镍的浓度较不敏感(IC50=216 μM)［13］。需要指出的是CaV1通道需要辅助亚基才能表现出正常的门控作用，而CaV3.1或CaV3.2不需要辅助亚基就可记录到类似心肌本身ICa，T。

2 T型Ca2+通道在心肌细胞中的动力学和电传导特性

T型Ca2+通道与L型Ca2+通道在门控和传导特性方面有明显区别。与L型CaV通道相比，T型Ca2+通道在较负的细胞膜电位开放，该电位与窦房结细胞的起搏电位相重叠。在生理状态下，T型Ca2+通道激活的阈值是-70～-60 mV，在 -30 ～ -10 mV T 型 Ca2+通道被完全激活［8，11，14-15］，激活的时间约为10 ms，去极化过程中电压每下降-10 mV约需要1～2 ms。细胞膜的去极化也导致T型Ca2+通道失活，失活阈值接近于-90 mV，-60 mV时通道失活一半，在膜电位＞-40 mV时通道则完全失活。失活的发生时间比L型Ca2+通道快。与 L型 Ca2+通道相比，T型 Ca2+通道以非Ca2+依赖的方式失活。激活和稳态失活在激活阈值-60～-30 mV中相交错，因此提供了一个持续的内向电流。在窦房结细胞中该电流参与舒张期缓慢去极，窦房结细胞则表现出自律性［10-11，16-17］。

在胚胎心脏中T型Ca2+通道表达广泛，但在出生后的心室肌细胞中T型Ca2+通道表达几乎检测不到或显著减少，有研究表明ICa，T电流存在实质上大幅度减少。在发育成熟心脏中，只有在心脏传导系统中的起搏细胞可以观察到高密度ICa，T。据报道猫心房中的起搏细胞和犬浦肯野细胞ICa，T峰电流密度可达2.5～3.5 pA/pF。与此相比，犬、蛙和大鼠心房细胞 ICa，T峰电流密度仅约为 0.5 pA/pF［11］。Rosati等发现在犬浦肯野细胞中CaV3.2mRNA表达较为丰富，高于CaV3.1两个数量级，ICa，T对镍较敏感(IC50=32 μM)。这提示在犬浦肯野细胞中CaV3.2是T型Ca2+通道主要组成部分［18-19］。此外，在兔窦房结细胞中可记录到ICa，T的峰电流是2～6 pA/pF，这比在兔心房和心室肌细胞记录到电流大10倍左右［14］。在其他相关研究中发现小鼠窦房结细胞CaV3.1mRNA表达比心房细胞高30倍［20］。ICa，T密度在各种哺乳动物也不相同，较小动物窦房结细胞ICa，T密度较大，随着动物体型的增大电流密度变小(小鼠 ＞ 豚鼠 ＞ 兔 ＞ 猪)［10］。此外，ICa，T可部分影响心率，使哺乳类动物具有各自的心率特异性。使用分子生物学技术分析人类心肌细胞，经mRNA的斑点印迹和RNA 印迹识别可记录到 CaV3.1 和 CaV3.2［21-22］。Chandler等发现人窦房结和右心房在mRNA和蛋白质水平上CaV3.1均有表达，且窦房结区域远高于右心房，但CaV3.2mRNA表达低于检测阈值［23］。尽管如此，目前还不能确定在人类心房，心室和窦房结细胞中 ICa，T是否功能性存在［24-25］。

3 T型Ca2+通道表达的发展变化

T型Ca2+通道的电流密度和表达水平在胚胎时期就在发生变化，T型Ca2+通道在早期胚胎心脏中主要提供其电学活动。在小鼠胚胎心脏发育中期CaV3.1主要承担T型Ca2+通道的功能作用［26］。在大鼠胚胎心脏发育中期至围产期这一阶段 CaV3.1和 CaV3.2均担负 T型 Ca2+通道功能作用［27］。Niwa等发现在妊娠9.5 d的胚胎小鼠心室肌中CaV3.2mRNA是主要表达亚型。随着胚胎的发育，CaV3.2 mRNA表达逐渐减少，而CaV3.1mRNA表达逐渐增加。小鼠通常在妊娠20 d左右出生，妊娠18 d的胚胎小鼠心室肌中CaV3.2mRNA表达仍占有一定优势。在心脏发育成熟阶段，CaV3.1mRNA则占主要表达，CaV3.2mRNA表达可忽略不计。电生理实验表明，在妊娠9.5～18 d的胚胎小鼠心室肌中，T型Ca2+通道功能没有显著差异，ICa，T对镍均非常敏感。该研究结果表明在小鼠胚胎期心室肌中ICa，T以CaV3.2电流为主［28］。出生以后，ICa，T的电流密度随着机体的发育而进一步减少。在大鼠心房肌细胞，13周龄ICa，T密度减少到5周龄(1.2～1.4 pA/pF)的三分之一。在大鼠心室肌细胞中，大鼠出生8 d时ICa，T仍可以被记录到。3周龄时，尽管CaV3.1和CaV3.2 的表达仍存在，ICa，T很难再被记录到［11］。有趣的是，在大鼠妊娠不足18 d的胚胎和新生1 d的心室肌细胞中，CaV3.1和 CaV3.2亚基的转录水平明显与 CaV3.1和 CaV3.2相关的IT-Ca功能水平不匹配。然而，围产期CaV3.1mRNA表达数量与 CaV3.1相关的 ICa，T密度相一致。由此可见，CaV3.1和 CaV3.2 受转录和转录后机制的调控［27］。最近研究发现ICa，T存在于小的单核肌细胞和处于发育阶段猫心脏干细胞或祖细胞分化的心肌细胞里，T型Ca2+通道有可能是心脏多能干细胞或祖细胞分化为不同类型心肌细胞的关键调控因素［29］。

4 神经递质和激素调控T型Ca2+通道

心肌T型Ca2+通道活性是受各种神经递质和激素如内皮素、缓激肽、三磷酸腺苷(ATP)和α1肾上腺素受体激动剂等影响［11，30］。尽管蛋白激酶 C(PKC)对 ICa，T的影响目前有一些争议，这些激素经PKC介导作用于T型Ca2+通道。例如内皮素通过PKC增加大鼠心室肌细胞的ICa，T。缓激肽或ATP影响ICa，T的机制尚未确定。长期以来一直争论β肾上腺素受体激动剂对ICa，T的影响。据报道，ICa，T是否受异丙肾上腺素的影响，往往取决于实验条件和研究的对象。尽管ICa，T在很多生理条件下可能被β肾上腺素刺激和G蛋白调控，目前还是普遍认为ICa，T不受β肾上腺素刺激的影响。已发现在牛蛙心房肌细胞中G蛋白参与调控T型Ca2+通道，但在豚鼠心室肌细胞中并未发现此现象。Vassort等认为牛蛙心房肌细胞T型Ca2+通道是在G和Gi蛋白的双重控制下［10-11］。由于上述不一致结果，目前还不清楚 ICa，T受激素和神经递质调控是否存在于常见的生理活动。相比之下，通过重组通道蛋白研究建立了α、β、γ亚基、花生四烯乙醇胺、花生四烯酸和一个磷酸化过程受Ca2+/钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的直接反应。例如，一氧化氮选择性抑制CaV3.2但不影响CaV3.1通道。CaV3.2通道受CaMKⅡ影响。此外，重组CaV3.1 和 CaV3.2 通道受蛋白激酶 A 调控［31］。

5 T型Ca2+通道对心脏起搏的贡献

由于T型Ca2+通道普遍存在于成年心脏的传导系统中，激活ICa，T的电压与起搏电位相重叠，这提示T型Ca2+通道在起搏细胞去极化和自律性中扮演了关键的角色［14，16］。Hagiwara和Doerr最初的研究利用镍阻断T型Ca2+通道仅轻微减慢兔窦房结细胞冲动发放的频率［14，32］。目前已发现有7种以上的电流组成了窦房结细胞的起搏电流。它们不仅包括 ICa，T，也包括 ICa，L、持续内向电流、背景内向电流、超极化活性的内向电流、延迟整流钾电流、毒蕈碱钾电流和钠/钾泵电流。在典型窦房结细胞中起搏电流约为5pA的内向电流。其中内向电流 ICa，T＜1 pA，这明显小于其他电流［10，33］。由于ICa，T小而短暂的特性，通过模型计算减去 ICa，T，只减少起搏电流几个百分点。为了验证这些实验结果，制备敲除CaV3.2的小鼠模型，发现小鼠仍具有正常窦性节律，并未出现心律失常，但反复出现冠状动脉痉挛［34］。这些研究结果提示ICa，T可能不是一个主要的起搏电流，它对起搏频率的影响很微弱。然而，ICa，T阻断剂咪拉地尔可明显减慢窦房结细胞的自律性［35］。咪拉地尔在浓度依赖的条件下选择性地抑制后期起搏细胞的去极化，但并不影响动作电位的幅度和持续时间［36］。依福地平也抑制后期起搏细胞的去极化，并且它对阻断 ICa，T和 ICa，L有类似的效能［35］。一项临床研究也证实口服咪拉地尔可以降低窦房结的起搏活性［37］。对比以往这些研究还仅仅是推测，目前进一步深入研究ICa，T对起搏的影响更具有意义。围绕过去和最近研究的差异有几个因素应该指出，在既往的研究中经常利用镍(40～100 μM)来研究定量估算ICa，T对起搏电流的贡献［14］。然而，对镍的敏感度并不能用来鉴别 ICa，T和 ICa，L。因为，CaV3.1 对镍不敏感，CaV3.2 对镍则敏感，CaV3.1和CaV3.2均在窦房结细胞中表达。CaV3.1 mRNA在小鼠窦房结细胞的表达约为心房肌细胞的30倍。CaV3.2也存在，表达适中。此外，缺乏CaV3.1表达的小鼠显示窦房结起搏活动和房室传导均出现异常［38］。这些结果提示，以往的研究通过测量ICa，T对镍敏感性会低估ICa，T的电流密度。咪拉地尔显著降低细胞冲动频率的发放或其他阻滞剂部分阻断CaV3.1，这些T型Ca2+通道阻断剂也可能影响其它离子电流包括ICa，L。在以往的研究中使用相对有限的特异性药物如:咪拉地尔和依福地平等，需要更仔细地研究和分析。在窦房结细胞中评估ICa，T是困难的，实际上ICa，L在窦房结细胞中不止 CaV1.2(α1C)电流，也有 CaV1.3(α1D)电流［39］。CaV1.3 的激活阈值约 -60 mV，显然与 ICa，T的激活电压相重叠。因此，依靠不同的钳制电压从ICa，L分离ICa，T并不能正确的评估窦房结细胞的ICa，T。另一方面，在窦房结和心房之间的交接区ICa，T对自律性的影响，似乎比较有研究意义。Huser等已经证明在猫心房起搏细胞中，通过T型Ca2+通道的Ca2+内流，触发肌浆网内Ca2+释放，继而激活Na+/Ca2+交换体的“前向模式”，促进起搏细胞的去极化［40］。这种机制也是正常的窦房结细胞的功能，窦房结细胞的放电频率或多或少受兰尼定或咖啡因的影响而减少［41-42］。已发现在肺静脉的心肌细胞中T型Ca2+通道可以诱发阵发性心房颤动。ICa，T对该区域发生心律失常具有重要作用。因此，ICa，T直接和间接参与窦房结和心脏其他区域起搏细胞去极化。这一机制对于衰竭的心脏尤其重要［11］。有报道在病理条件下(如压力负荷导致的心肌肥厚、心肌梗死和心力衰竭)动物模型中T型Ca2+通道进行重新表达。在快速起搏犬心房模型中，依福地平已被证明可有效预防心房重构［43］。在培养的新生大鼠的心室肌细胞中，随着醛固酮剂量的增加心室肌细胞自律性的频率超过以前的4倍，且CaV3.2的表达也增加［44］。各种哺乳动物的心率是不同的，小动物心率非常快如小鼠、大鼠和豚鼠，大动物心率较慢如猪、大象和人类。ICa，Ta可部分地解释不同哺乳动物具有的不同心率。因为小动物ICa，T的电流密度大，随着身材的增大而ICa，T的电流密度变小(小鼠＜豚鼠＜兔＜猪)。有趣的是，在猪的窦房结细胞中ICa，T小到可忽略不计［10］。然而，这些研究结果并不表明 ICa，T不存于人类的窦房结细胞。近来，Verkerk等在人类的窦房结细胞记录到一个大的内向电流，但对这种电流未作详细的分析。目前为止，在人类心肌细胞中还从未记录到ICa，T［24-25］。因此查清 T 型 Ca2+通道是否参与人类心脏的自律性，进一步的研究非常必要。

6 T型Ca2+通道的电重构和病理意义

当心脏处于病理应激状态下时(如主动脉结扎的动物，心肌梗死，长期接触内皮素-1、血管紧张素Ⅱ或醛固酮)会诱发心肌肥厚和心力衰竭，心脏的T型Ca2+通道会重新表达。大鼠心室肌细胞中增加的ICa，T对镍有较高的敏感性，具有CaV3.2的特征。经分子生物学分析，CaV3.2mRNA保持不变，而 CaV3.1mRNA 却增加了［11］。另一方面，Yasui等报道在小鼠主动脉结扎引起的心肌肥厚模型中，CaV3.1mRNA表达下降，但CaV3.2mRNA表达与对照组相当［45］。此外，最近的一项研究报道，长期给予野百合碱的大鼠，在其肥大的右心房细胞中，ICa，T明显增加，而 CaV3.1 和 CaV3.2mRNA 表达水平不变［46］。T型Ca2+通道表达的调控机制已被发现。血管紧张素Ⅱ影响大鼠心肌肥厚的发生，ICa，T和CaV3.1mRNA也伴随增加。血管紧张素Ⅱ通过AT1活化有丝分裂激活蛋白(MAP)激酶(MEK)依赖通路来调控 CaV3.1 转录［47-48］。内源性内皮素通过ETa激活MEK独立通路进行CaV3.1转录后的调控。此外，据报道一个转录抑制成分命名为限制性神经元沉默元素(NRSE)和一个转录子(限制性神经元沉默因子NRSF)作为NRSE结合蛋白，调控 CaV3.2表达［49］。在心室肌细胞NRSE-NRSF系统通常抑制心钠素(ANP)和B型利钠肽(BNP)基因的转录。病理状态下，去抑制(NRSF介导抑制ANP和BNP)再激活ANP和BNP基因的表达。有意思的是在ANP的3＇-端非编码区和CaV3.2基因的第一内含子中表现了与NRSE相似的基因顺序。实际上，心脏特有的NRSF失活导致扩张型心肌病，且心室肌细胞CaV3.2表达也增加，这导致心律失常和猝死发生率增加。NRSF是一个关键的转录调控因子，维持了正常成熟心肌细胞的表型，同时也抑制若干胚胎时期心源性基因(如CaV3.2)的再次表达［49］。

T型Ca2+通道表达受心脏转录因子的调控。心脏同源转录因子Csx/Nkx2.5(NKx2基因家族的一种)表达于脊椎动物的心脏发育阶段。把含有Csx/Nkx2.5的腺病毒感染新生大鼠的心肌细胞，可发现心肌细胞自律性明显增加，这与增加对CaV3.2调控有关［50］。最近，通过雌激素作为对心率的负面影响因素，围绕Csx/Nkx2.5和CaV3.2参与对心率的基因调控已被证实。Marni等发现心肌细胞被17β-雌二醇干预24 h后，不依赖雌激素受体就可下调 ICa，T峰电流和 CaV3.2 mRNA表达。Csx/Nkx2.5也被17β-雌二醇抑制。细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)-1/2(ERK5抑制剂，PD-98059)可终止 17β-雌二醇对 ICa，T、CaV3.2mRNA 以及 Csx/Nkx2.5mRNA的影响。他们还发现，卵巢切除术后可使心率增加，17β-雌二醇替代疗法可降低卵巢切除术后大鼠的心率。这一结果表明雌激素通过激活ERK-1/2，ERK-5减少CaV3.2表达，这一过程可通过抑制Csx/Nkx2.5相关转录来调控［51］。

提高T型Ca2+通道的表达应该可以增加Ca2+内流入心肌细胞，这与钙超载和心律失常相关病理机制有关。以往的研究表明，尽管在正常条件下T型Ca2+通道可能对触发Ca2+释放提供了很小的贡献，通过T型Ca2+通道Ca2+内流可以触发 Ca2+诱导肌浆网释放 Ca2+［44，49］。总的来说，ICa，T这种兴奋收缩偶联效应的生理作用已被发现报道。利用小鼠心肌的特异性条件表达CaV3.1，提示CaV3.1过度表达所增加的Ca2+内流只是轻微增加心肌收缩力，并未导致心肌病理改变和过早死亡。与此对比，通过L型Ca2+通道增加Ca2+内流需要β2a亚基过度表达才可以。T型和L型Ca2+通道是心肌细胞膜不同部分，Ca2+通过这些通道内流对心肌细胞收缩产生不同的影响［52］。在心脏不同的发育阶段，T型和L型Ca2+通道对心肌兴奋收缩偶联效应扮演了不同角色。在大鼠出生后早期，心肌Ca2+通过细胞膜通道内流占主导地位。大鼠出生三周以后，Ca2+内流诱导肌质网Ca2+的释放则占据主导地位。这种转变伴随着ICa，T的消失，可能反映了细胞膜T型管系统在逐渐发育成熟。最近，Chiang等发现在激活病理性心肌肥大的过程中，CaV3.2扮演了核心角色［15］。他们发现缺乏CaV3.2的小鼠明显抑制压力负荷所致的心肌肥大，但缺乏 CaV3.1的小鼠并不能抑制此过程。缺乏CaV3.2的小鼠也可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚。众所周知，Ca2+/钙调蛋白丝氨酸/苏氨酸钙调磷蛋白磷酸酶在心肌肥厚的病理发展中起了关键作用。细胞内高Ca2+浓度诱导细胞质去磷酸化激活T细胞核因子，并诱导NFAT在细胞质易位到细胞核。最近的几项研究表明，在啮齿动物模型中过渡蛋白质受体TRPC1，TRPC3和TRPC6都参与了钙调磷酸酶/激活T细胞核因子(NFAT)活化和心肌肥厚［53］。实验表明在异常的Ca2+信号传导中CaV3.2是Ca2+内流的候选途径。事实上，缺乏CaV3.2的左心室在压力负荷下NFAT可被直接激活。此外，依福地平(T型Ca2+通道阻断剂)可通过抑制钙调磷酸酶-NFAT活化预防新生小鼠心肌细胞肥大［54］。这些结果提示在心肌细胞Ca2+依赖的信号通路中T型Ca2+通道拥有不同的角色。诱使Ca2+进入细胞质，T型Ca2+通道可能比 L 型 Ca2+通道更有效［6，11，52］。

7 结语

本文总结了目前心脏T型Ca2+通道相关知识，汇集的相关证据表明在心肌细胞的发育、自律性和兴奋收缩偶联以及心肌肥厚和心力衰竭的病理过程中T型Ca2+通道的重要功能作用。心肌细胞膜有L型和T型Ca2+通道两种表达类型。L型Ca2+通道广泛存在与心肌细胞，主要参与细胞兴奋收缩耦连效应和起搏活动。T型Ca2+通道的功能角色则具有多样性。心脏T型Ca2+通道蛋白主要有两种异构体CaV3.1和CaV3.2，在胚胎心肌细胞中有广泛表达，但是随着心脏的发育，表达明显减少。在成年心脏中，心室肌细胞T型Ca2+通道几乎检测不到，但在心脏传导系统则有广泛的表达，并发挥功能角色如窦房结细胞的起搏去极化。有趣的是T型Ca2+通道在心肌肥厚和心力衰竭等各种病理条件下可重新在心房和心室肌细胞表达，并参与异常电活动和兴奋收缩偶联效应。但与L型Ca2+通道相比，T型Ca2+通道对激发肌质网释放Ca2+贡献较小。T型Ca2+通道在心肌肥厚病理过程中起到至关重要的作用。通过CaV3.2增加Ca2+内流，T型Ca2+通道诱导钙调磷酸酶/NFAT致心肌肥厚信号产生，即Ca2+触发异常Ca2+依赖性信号通路。因此，T型Ca2+通道可以作为治疗心血管疾病最有希望的靶点。可以预见，T型Ca2+通道阻断剂将会引导一些心血管疾病(心肌肥厚、心律失常和心力衰竭)新治疗药物的发展。

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