Ad-Egr-hTrail联合放射线对脑胶质瘤细胞杀伤作用的实验性研究

刘桂红 章龙珍 唐天友 刘美艳 赵丽

脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，约占全部颅内脑肿瘤的35% ～40%。目前，胶质瘤的治疗仍以手术、放疗为主。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长，手术难以彻底切除，而且某些肿瘤生长于重要的脑功能区，多为手术禁区，使得放射治疗成为脑胶质瘤综合治疗中一个重要的辅助方法。但胶质瘤对射线较抗拒，加上正常脑组织耐受剂量的限制，导致脑胶质瘤放射治疗的总体疗效不理想。

肿瘤基因-放射治疗目的就是试图通过提高肿瘤的辐射敏感性的同时降低正常组织的辐射损伤开辟新的治疗途径与方法。研究发现Egr-1启动子可诱导辐射敏感性，而TNF相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常组织无损伤，因此若将两者共同构建表达调控体，就能很好地达到肿瘤基因-放射治疗的目的。因此本实验在以CMV作为启动子的腺病毒重组载体Ad-CMV-hTrail作为对照的基础上，研究Ad-Egr-hTrail单独及联合放射线对脑胶质瘤细胞的杀伤作用，为临床脑胶质瘤基因-放射治疗进一步研究提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 携带人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒重组载体Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail为上海交通大学医学院生物化学教研室葛盛芳博士惠赠，U251脑胶质瘤细胞株购自中科院生物细胞学研究所。MTS检测试剂盒(Promega);DMEM培养基(GIBCO)。PCR反应试剂盒(Fermentas公司);100bp Marker(天为时代公司);引物序列由上海生物工程公司合成：

上游引物(P1)：5＇-GCTGCCTGGCTGACTTACA-3＇，下游引物 (P2)：5 ＇-TGGCTGGTCTAGACAGATTGC-3 ＇，扩 增 片 断为1037bp。

1.2 实验方法

1.2.1 重组腺病毒的扩增 、纯化和滴度测定 将携带Ad-Egr-hTrail的293包装细胞从-70℃冰箱取出，-70℃/37℃反复冻融3次，以裂解细胞，释放重组病毒。将上述细胞裂解液移至离心管中，12000rpm，离心10 min。吸取含病毒的上清液，感染AE25 crma细胞，大量扩增重组腺病毒。Ad-CMV-hTrail扩增方法同上。然后纯化及滴度测定。

1.2.2 重组腺病毒的PCR鉴定 为了检测重组腺病毒是否携带目的基因Trail，裂解腺病毒，提取重组病毒基因组 DNA，以上述病毒DNA为模板，加入引物P1和P2于 PCR反应体系，进行PCR反应。PCR反应条件：先95℃预变性5 min;接着94℃ 1 min;60℃1 min;72℃ 90 s;再72℃ 延伸10 min，共30个循环。

1.2.3 实验分组 实验分成6组：空白对照组，Ad-EgrhTrail组(Egr组)，Ad-CMV-hTrail组(CMV 组)，Ad-Egr-hTrail+照射组(Egr+照射组)，Ad-CMV-hTrail+照射组(CMV+照射组)，单纯照射组。

1.2.4 病毒感染 取指数生长期的U251细胞，接种在96孔细胞培养板中，1×104细胞/孔，每孔 100 μl，每组设4个复孔，48 h后用移液器先将培养板内培养液吸尽，然后每孔加入50 μl新鲜培养液。将Ad-CMV-hTrail及Ad-Egr-hTrail按MOI=100分别感染U251脑胶质瘤细胞，无病毒感染组(对照组，单纯放疗组)加入等量的PBS液，使病毒与细胞充分接触，置于孵箱内继续培养。病毒感染肿瘤细胞2 h后，每孔再补加50 μl新鲜培养液，继续培养。感染2 d后，倒置显微镜下观察细胞感染情况，并拍照。

1.2.5 照射条件 病毒感染2 d后给予12 Gy-X射线一次性照射，无照射组给予0 Gy-X射线假照射。SSD=100，剂量率0.684 Gy/min。

1.2.6 MTS法测定 MTS法检测细胞相对存活率。将Cell-Titer 96 aqueous one solution reagent置于室温，使试剂完全解冻，备用。吸弃培养孔中的培养液，每孔内加入100 μlDMEM和 20 μl的 CellTiter 96 aqueous one solution reagent(同时以只含 100 μlDMEM 和 20 μl的 CellTiter 96 aqueous one solution reagent的培养孔作为调零孔)，培养箱中培养4 h，然后上酶标仪测定490nm处的吸光值(OD值)。按下式计算肿瘤细胞抑制率(每组实验重复3次)：肿瘤细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100/100

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0统计学软件进行两独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组腺病毒的扩增 倒置相差显微镜观察：重组腺病毒Ad-Egr-hTrail或Ad-CMV-hTrail感染AE25 crma细胞后五日，AE25 crma细胞变圆，聚集成团，呈现明显的病理效应，表明病毒开始大量扩增，此时开始收集病毒。无病毒感染的AE25 crma细胞为多边形，呈现均匀的贴壁生长。

2.2 重组腺病毒的PCR鉴定 以病毒Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail DNA为模板加入引物后进行PCR反应，如期扩增出1037bp的hTrail片断，表明hTrail全长被成功插入到腺病毒基因中。

2.3 两种腺病毒重组载体及放射线对 U251细胞增殖的影响

2.3.1 Ad-Egr-hTrail对U251细胞增殖的影响 本实验结果显示，单用Ad-Egr-hTrail对U251胶质瘤细胞的抑制率仅为5.49%，与空白对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);但Ad-Egr-hTrail与 12 Gy-X射线联合作用时，抑制率为40.77%，杀伤率提高了7.43倍，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3.2 Ad-CMV-hTrail对U251细胞增殖的影响 单用Ad-CMV-hTrail对U251细胞的抑制率为24.61%，与单用放射治疗组的抑制率(29.55%)相当(P＞0.05)，与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);与12 Gy-X射线联合作用时，抑制率为45.15%，杀伤率提高了1.84倍，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3.3 两种腺病毒重组载体联合放射线对U251细胞增殖的影响 Ad-Egr-hTrail+照射组及Ad-CMV-hTrail+照射组对U251胶质瘤细胞的抑制率分别为40.77%、45.15%，二者之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);与单次大剂量(12 Gy)的放射治疗抑制率(29.55%)相比，其放射增敏比分别为1.38、1.53倍。以上结果见表1。

表1 两种腺病毒重组载体及放射线对U251细胞增殖的影响

3 讨论

选择有效的目的基因是肿瘤基因-放射治疗的关键。Trail是近年来发现的肿瘤坏死因子家族的新成员，由于其最显著特点是仅诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞则无毒性作用［1］，成为目前的研究热点。Kagawa等［2］采用表达人 Trail基因的腺病毒载体，在体内外转染胶质瘤细胞系及肿瘤，证明其抗肿瘤作用具有旁观者效应，即在被转入Trail基因的肿瘤细胞周围，未被转入Trail基因的肿瘤细胞也出现凋亡现象。此外，Trail诱导肿瘤细胞的凋亡不依赖p53基因是否突变，而常规放射疗法在肿瘤抑制基因p53基因突变的情况下则出现辐射抗性。研究表明，在高达50%的高级别胶质瘤中p53发生突变或缺失，因而在放疗中发生DNA损伤的肿瘤细胞亦能存活和繁殖，且有恶性度增加的趋势［3］。研究发现不仅放疗能通过提高肿瘤细胞DR5受体的表达而增强Trail治疗的敏感性［4］，而且Trail亦能增加胶质瘤细胞对放射线和化疗药物敏感性［5，6］。因此TRAIL与放疗的联合应用，不仅减少了单独应用放疗的毒副作用，而且还起到互相增敏作用。

转移基因的体内表达调控是基因治疗的关键技术之一，目前在肿瘤基因治疗中往往采用启动子调控体内转移基因的表达，所用的启动子分三类：第一类能够强而持久的驱动下游基因的表达(如 CMV);第二类有组织或肿瘤特异性(如AFP);第三类活性受控于诱导剂或阻遏剂。Egr-1启动子属于第三种，它与一般组织特异启动子诱导持续基因表达不同，Egr-1启动子受到辐射诱导后的表达为超强性，当辐射反应结束后随之减弱或终止［7］。Egr-1基因启动子序列中的放射敏感性CArG盒可感受体内外理化刺激如自由基、电离辐射等，诱导Egr-1基因表达，从而对与之相连的外源基因实现双向性调控作用［8］。国内相关的研究报道较少。

我们利用Ad-Egr-hTrail感染U251细胞，在以Ad-CMV-hTrail感染作为对照的基础上，联合放射治疗，发现：①单纯Ad-Egr-hTrail对U251胶质瘤细胞的抑制率仅为5.49%，与对照组无明显差别，但当给与12 Gy-X的照射后，对肿瘤的抑制率高达40.77%，提高了7.43倍，说明Ad-Egr-hTrail具有较强的辐射诱导特性。Egr-1启动子在感受电离辐射刺激后，的确可以诱导人TRAIL基因的表达，提高TRAIL基因的抗肿瘤作用。Staba等［9］Ad-Egr-TNFα转染人恶性胶质瘤D54的裸鼠模型，联合辐射也得出类似的结果。②单纯Ad-CMV-hTrail对U251胶质瘤细胞的抑制率为24.61%，与单纯大剂量辐射(12 Gy)的抗肿瘤效应(29.55%)相当。说明CMV是一种强而持久的启动子，其诱导下游基因Trail表达的抗肿瘤作用可以近似达到单次大剂量辐射的效应。当两者联合作用时，对肿瘤的抑制率增加到45.15%，仅提高了1.84倍，说明放射治疗可增加Ad-CMV-hTrail对U251胶质瘤细胞的杀伤作用，但CMV启动子无明显的辐射诱导特性。③Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail两种腺病毒重组载体联合放射线对U251细胞抑制率明显高于单独放射治疗组(29.55%)，其放射增敏比分别为1.38、1.53倍，说明人Trail基因具有辐射增敏作用。

本研究的特色在于把抗肿瘤基因的最新研究成果与辐射研究结合起来，将人Trail基因置于辐射诱导性启动子Egr-1调控之下，通过辐射诱导人Trail基因的表达，实现了基因表达的时空调控，解决了基因治疗中目的基因表达难控制的问题。一方面，辐射作为诱导剂自身不仅具有抗肿瘤作用，而且能提高基因靶向转移的效率，相对延长转基因的表达时间［10］。另一方面，具有辐射增敏作用的基因表达产物由于辐射的靶向性而局限于肿瘤局部，既发挥了对肿瘤的治疗作用，又使其系统毒性最小化。因此将辐射与携带治疗基因的辐射诱导表达载体联合治疗恶性肿瘤，将会发挥更加理想的疗效。本实验进一步证实了采用放射诱导的启动子来增强目的基因的表达是切实可行的有效的基因治疗方法。

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