体视学定量法评估氧控制性再灌注对犬体外循环肺缺血再灌注早期损伤的保护作用

荣 健 叶 升 梁孟亚 刘 海 陈光献 黄伟明 吴钟凯*

1(中山大学附属第一医院麻醉科，广州 510000)

2(中山大学附属第一医院肿瘤科，广州 510000)

3(中山大学附属第一医院心外科，广州 510000)

引言

肺缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)引起的肺功能障碍，是体外循环心脏手术后最常见的并发症和导致死亡的主要原因之一[1]。研究表明，控制性再灌注具有围缺血期器官保护作用[2]。氧控制性再灌注可抑制心脏受损，提高再灌注后心脏功能[3]。但在肺缺血再灌注损伤方面，控制性再灌注研究多集中于离体肺或肺移植领域，在体外循环肺缺血再灌注损伤领域未见研究。

体视学根据平面(二维)图像数据，通过数理统计方法，推导出反映空间(三维)结构参数，属于定量分析方法。本研究根据体视学方法评估氧控制性再灌注对体外循环肺缺血再灌注早期损伤的作用，寻求体外循环肺缺血再灌注损伤的保护措施。相关研究国内外未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康犬 14只，雌雄不限，体重(19.2±3.09)kg，广州白云区穗北实验动物养殖场提供。依据体外循环中吸入氧浓度方案的不同，随机分为缺血再灌注组(IR组)和氧控制性再灌注组(OCR组)，每组7只。IR组全程FiO280%;OCR组在主动脉开放即刻调整 FiO2至40%，随后每5 min依次上调10% ，最后达80% ，其余时段均维持FiO280% 。

1.2 麻醉方法及手术过程

肌肉注射氯胺酮40 mg/kg(福建古田药业有限公司)和芬太尼 2 μg/kg(宜昌人福药业有限公司)，静脉注射维库溴铵0.1 mg/kg(浙江仙琚制药股份有限公司)行气管插管，呼吸机(BIRD VELA，Model 606 A，USA)维持机械呼吸(潮气量 13～15 mL/kg，呼吸频率12～16次/min)，股动、静脉分别插管测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)及中心静脉压(central venous pressure，CVP)。胸骨正中劈开，切开心包，右心房内注射肝素3 mg/kg，主动脉和上下腔静脉分别插入16 F和18 F(Edwards Lifesciences LLC，Irvine，USA)插管，连接人工心肺机。升主动脉根部插入并固定16号针头，连接灌注装置。采用3 M人工心肺机，Medtronic膜肺(AFFINITY NT 541，Medtronic Inc.，USA)，Sarns变温水箱(Sarns Heater/Cooler，Ann Arbor，MI)，以及东莞科威医疗仪器厂的塑料管道。两组均以犬血部分预充。

1.3 CPB管理

两组犬 CPB开始后，维持流量50～80 mL·min-1·kg-1，并体循环 10 min，阻断升主动脉后，在主动脉根部灌注 4℃改良 ST.Tomas停跳液 15 mL/kg，阻断升主动脉60 min后开放升主动脉，开放后辅助循环90 min。在开放主动脉后，如心脏出现室颤，则使用交流电除颤复跳。

1.4 标本采集及指标检测

在开胸后即刻(T1)、主动脉开放25 min(T2)、主动脉开放90 min(T3)留取肺标本，部份以5%的福尔马林液固定，石蜡包埋，切片HE染色;部份进行W/D测定。

1.5 分析方法和图像分析软件

病理标本HE染色。每张切片在40倍物镜下随机选取10个视野，经Leica显微摄像系统输入计算机，用 Image-Pro图像分析软件进行测试。测试前，首先用物镜测微尺对该软件进行标定。

1.6 体视学参数的选择和计算

选用的测量参数有：肺泡间隔中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)计数、肺泡间隔面积密度(area and density of pulmonary alveolar septum，PASAD)、肺泡腔体积密度和肺实质红细胞体积密度。根据 Image-Pro图像分析软件的测试结果，按体视学公式计算出上述参数[4]。

1.7 肺组织湿重与干重比值

肺组织于4℃生理盐水中漂洗，剔除结缔组织，用滤纸吸干表面液体，称湿重;然后置于80℃烘箱中48 h去除水分，再称干重，计算湿干重比(W/D)。

1.8 统计分析

所有计量数据运用均数±标准差进行统计描述分析，计数数据运用百分位数进行统计描述分析。为检验组间差异，对计数数据(discrete variable)进行组间比较，采用多个独立样本非参数检验(K independent samples test);对计量数据 (measurement data)，采用单因素方差分析(AVON)。对重复测量数据比较采用重复测量数据的方差分析(repeated measures analysis of variance)，P＜0.05认为有统计学差异。

2 结果

2.1 光学显微镜检查

图1为IR和OCR两组的肺损伤比较，两组犬肺组织在主动脉开放后均出现炎性细胞渗出、肺间质水肿、肺间隔增厚等病理改变，但 OCR组组织病理学损伤程度相对较轻。按 Arold SP方法[5]对肺损伤进行5级分类：0=最小损伤，1=轻度损伤，2=中度损伤，3=严重损伤，4=极度损伤。400倍光镜下任取10个视野，计算平均每个视野所得分均值代表损伤程度。T2时点两组肺损伤评分：(3.8±0.5)vs(2±0.7)，P ＜0.05;T3时点两组肺损伤评分：(4.2 ±0.8)vs(2.6 ±0.6)，P ＜0.05。

图1 两组肺损伤比较(HE stain，40×)。(a)IR组 T1;(b)IR组 T2;(c)IR组 T3;(d)OCR组T1;(e)OCR组T2;(f)OCR组T3Fig.1 Lung injuries(HE staining of lung sections，40 × ).(a)IR group T1;(b)IR group T2;(c)IR group T3;(d)OCR group T1;(e)OCR group T2;(f)OCR group T3

2.2 肺泡间隔中性粒细胞(PMN)计数及肺泡间隔面积密度(PASAD)测定

表1为IR和OCR两组肺泡间隔中性粒细胞计数和肺泡间隔面积密度的比较。两组肺泡间隔中性粒细胞计数和肺泡间隔面积密度均逐渐上升，但在T2和T3时点，OCR组较IR组明显降低，P＜0.05。

表1 肺泡间隔中性粒细胞计数和肺泡间隔面积密度Tab.1 PMN count，the area and density of pulmonary alveolar septum of two groups

2.3 各组肺泡腔的体积密度

表2为IR和OCR两组肺泡腔体积密度的比较，可见两组肺泡腔体积密度均逐渐下降，但在T2和T3时点，OCR组较IR组明显增大，P＜0.05。

表2 两组肺泡腔体积密度Tab.2 Volume density of alveolus of two groups

2.4 各组肺组织红细胞的体积密度

表3为IR和OCR两组肺组织红细胞体积密度的比较，可见这两组密度均逐渐上升，但在T2和T3时点，OCR组较IR组明显降低，P＜0.05。

表3 两组肺组织红细胞体积密度Tab.3 Volume density of the erythrocyte in the lung of two groups

2.5 肺组织W/D比较

与T1相比，IR组和 OCR组 W/D在 T2、T3时点均明显增高(P＜0.05);两组相比，OCR组 W/D在T2、T3时点明显低于IR组相应时点(P＜0.05)。两者比较见图2。

图2 两组肺干湿重比较(*组间比较，P＜0.05;△与组内T1比较，P＜0.05)Fig.2 W/D weight in the two groups(* compared between the two groups，P ＜0.05.△ compared with T1 in the group，P ＜0.05.)

3 讨论

3.1 体视学方法评估体外循环肺缺血再灌注早期损伤

形态结构的改变是功能变化的基础，而功能变化反过来又影响其形态结构。体视学是“通过二维图像的定量分析获取数据以定量描述三维几何，并在微观组织分析中加以应用的方法”[6]，应用这种方法可以对肺实质急性损伤进行定量分析。

当肺泡受损时，炎症细胞(特别是中性粒细胞)聚集，肺泡间隔增厚并，有炎症细胞浸润。肺泡间隔中性粒细胞计数愈大，提示炎症程度愈厉害。肺泡间隔面积密度，是指在单位面积肺实质中，肺泡间隔所占的比例。肺泡腔的体积密度，是指单位体积的肺实质中肺泡腔所占的体积。当肺实质由于炎症、水肿、渗出、出血等原因导致肺泡腔体积减小时，肺泡腔体积密度会降低，其体积密度的变化随着肺实质炎性渗出的增多而减小。肺泡红细胞的体积密度，是指单位体积的肺实质中红细胞所占的体积。当肺组织因炎症或其他因素导致肺组织出血、充血时，其体积密度会增加。肺组织的病变越重，出血、充血越明显，其体积密度越大。本实验检测了体视学指标及反映肺损伤的湿干重比，发现体外循环肺缺血再灌注早期即有损伤出现，这与肺损伤五级评分结果相符。

3.2 体视学方法评估氧控制性再灌注的肺保护作用

肺损伤是临床体外循环术后最主要的并发症之一，其发病率高达15% ～30%[7]，肺缺血再灌注是其主要原因之一[1]。再灌注后氧供突然增加，在线粒体细胞色素P450系统作用下，产生大量毒性氧代谢产物;并且在再灌注大量氧供下，缺氧通过 p38 MAPK途径激活的黄嘌呤氧化酶产生大量ROS。这些活性氧代谢产物导致器官损伤。因此，再灌注期逐渐恢复氧供可减少ROS的产生，具有器官保护作用。有研究报道，氧控制性再灌注可保护肺血管内皮功能，减轻全身缺血再灌注导致的急性肺损伤[2];减轻脑 、小肠缺血再灌注损伤，抑制炎性反应[8-9];维持全身缺血再灌注时血流动力学的稳定[10]。无资料提示体外循环期间控氧对肺缺血再灌注损伤的作用。本实验将氧控制性再灌注应用于犬体外循环肺缺血再灌注模型，通过体视学定量方法来评价肺组织炎性细胞浸润、肺微血管通透性、肺组织充血出血，发现氧控制性再灌注可减轻体外循环肺缺血再灌注早期肺组织渗出，抑制中性粒细胞。结果表明，再灌注早期控制氧供可改善肺损伤的严重程度，但临床实施方案及远期效果有待进一步的研究。

3.3 体视学方法评估体外循环肺损伤的优势与精确性

二维定量研究是目前评价肺损伤的重要方法。但是，传统定量方法是在所要研究区域内任意选择少量的“典型”部位，运用二维定量技术对所研究的参数进行二维定量研究，但缺乏随机抽样。而体视学方法是基于二维切片的全面观察而获得显微结构的三维定量信息的精确手段，因此成为连接分子生物学和形态学研究、功能研究的桥梁，被《老年神经生物学》、《比较神经科学杂志》等国际杂志指定为定量方法。本研究采用体视学定量方法来评价体外循环肺缺血再灌注损伤及氧控制性再灌注的肺保护作用，与应用其他评价方法(髓过氧化物酶、丙二醛等)的意义相同[11]，表明体视学定量方法评价体外循环肺损伤具有一定的精确性，但临床应用需要进一步验证。

4 结论

通过体视学检测，结合组织学评分，发现在体外循环再灌注早期即可出现肺损伤表现，而在此阶段给予合适的控氧，可以达到一定的肺保护目的。但是，临床的实施需要更加深入的研究。

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