RP-HPLC法测定人血清中多索茶碱的浓度

王淑梅，张志清，杨秀岭，王楠，张君（.河北医科大学第二医院，石家庄市050000；.河北医科大学药学院，石家庄市 05007）

多索茶碱（Doxofylline）为新型的非腺苷阻滞性支气管扩张药，具有平喘、抗炎和镇咳作用。其疗效较茶碱强，耐受性好，且不良反应较茶碱少，在治疗支气管痉挛方面可能成为茶碱替代品[1]。文献[2]报道，多索茶碱对血管有独特的耐受性，对中枢神经和胃肠道等无影响；对患有严重肝功能损害或伴随喹诺酮类药物治疗的患者应进行血药浓度监测。反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定多索茶碱血药浓度已有文献报道[3，4]，样品处理方法主要有沉淀蛋白法和提取法。本试验采用RPHPLC法对人血清中多索茶碱的浓度进行测定，并探索和改进方法，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪，包括515泵、486检测器、Rheodyne 7725i进样阀、Empower Pro工作站（美国Waters公司）；GL-20G-Ⅱ离心机（上海安亭科学仪器厂）；GL-88B涡旋混合器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

多索茶碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100625-200301）；内标：咖啡因对照品（中国药品生物制品检定所，批号：171215-200608）；甲醇为色谱纯，异丙醇和三氯甲烷为分析纯。空白血清由健康受试者提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（30∶70）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：272 nm；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 多索茶碱对照品贮备液：准确称取多索茶碱对照品50.80 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解、定容，得质量浓度为1 016 μg·mL－1的多索茶碱对照品贮备液，于4℃冰箱中保存备用。

2.2.2 内标溶液：准确称取咖啡因对照品51.20 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解、定容，精密吸取1.5 mL该溶液置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，得质量浓度为30.72 μg·mL－1的内标溶液，于4℃冰箱中保存备用。

2.3 血清样品的处理

取血清样品0.4 mL，加入内标溶液10 μL，再加入异丙醇-三氯甲烷（1∶4）5 mL，涡旋混合1 min，4 000 r·min－1离心10 min，取下清液4 mL置于离心管中，50℃恒温水浴中氮气吹干，残渣加流动相100 μL溶解，取20 μL进样。

2.4 方法专属性

在“2.1”项色谱条件下，血清中内源性杂质对测定无干扰，多索茶碱与内标峰形良好，分离完全，其保留时间分别为9.5、6.4 min。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血清；B.空白血清+多索茶碱对照品+内标；1.多索茶碱；2.咖啡因Fig1 HPLC chromatogramsA.blank serum；B.blank serum+reference substance+internal substance；1.doxofyline；2.caffeine

2.5 标准曲线的制备

精密量取空白血清0.4 mL，加入多索茶碱系列对照品溶液及内标溶液各10 μL，摇匀，使多索茶碱浓度分别为0.101 6、0.254、0.508、1.016、2.302、4.064、8.128 μg·mL－1，按“2.3”项下方法操作，记录色谱。以多索茶碱浓度（X）为横坐标，多索茶碱与咖啡因峰面积之比（Y）为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程为Y＝0.986 8X+0.022 8（r＝0.999 8）。结果表明，多索茶碱血药浓度在0.1016～8.128 μg·mL－1范围内线性关系良好。最低检测浓度为0.011 μg·mL－1。

2.6 回收率试验

2.6.1 提取回收率：分别配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3种浓度的血清对照品溶液各3份，按“2.3”项下方法操作并测定，以所得的色谱峰面积与相应浓度多索茶碱对照品溶液直接进样获得的色谱峰面积进行比较，考察样品提取回收率。3种浓度下多索茶碱提取回收率分别为93.59%、95.52%和92.32%，RSD分别为5.55%、2.22%和3.75%。

2.6.2 方法回收率：分别配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3种浓度的血清样品各3份，按“2.3”项下方法操作并测定，测得多索茶碱浓度，以实测浓度与加入浓度之比计算方法回收率，结果见表1。

2.7 精密度试验

分别配制低、中、高（0.254、1.016、4.064 μg·mL－1）3种浓度的血清样品各3份，按“2.3”项下方法操作，于同日内和5 d分别进样分析，测定日内及日间精密度，结果见表1。

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表1 回收率及精密度试验结果（±s，n＝3）Tab 1Results of recovery and precision test（±s，n＝3）

表1 回收率及精密度试验结果（±s，n＝3）Tab 1Results of recovery and precision test（±s，n＝3）

加入浓度/μg·mL-1 RSD/%4.65 8.60 3.74测得浓度/μg·mL-1方法回收率/%RSD/%0.254 1.016 4.064 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 84.57 93.82 92.93 4.65 7.34 2.91日内精密度测得浓度/μg·mL-1 0.214 8±0.01 0.953 3±0.07 3.77 7±0.11 RSD/%4.65 7.34 2.91日间精密度测得浓度/μg·mL-1 0.214 7±0.01 0.929 6±0.08 4.011±0.15

2.8 样品稳定性考察

配制中浓度（1.016 μg·mL－1）的血清样品，按“2.3”项下方法操作，分别在0、2、4、8 h时测定，记录色谱峰面积，计算多索茶碱含量。结果表明，处理后的血清样品室温下放置8 h内稳定，RSD＝1.13%（n＝3）。另配制中浓度的血清样品，反复冻融（－20℃）3次后，按“2.3”项下方法操作。结果表明，样品反复冻融3次后性质稳定，RSD＝1.60%（n＝3）。

3 讨论

本试验通过查阅文献，优选出的色谱条件以甲醇-水（30∶70）为流动相，配比简单，性质稳定，内源性杂质对测定无干扰。内标咖啡因在该色谱条件下，与多索茶碱完全分离，峰形和保留时间均较理想。样品处理采用异丙醇-三氯甲烷（1∶4）进行提取，提取液简便易得，可避免因沉淀蛋白不完全而造成的色谱柱堵塞。

试验表明，本方法简便、准确、灵敏度高、特异性好，可用于多索茶碱的血药浓度测定及其临床药动学研究。

[1]顾 健，张春燕，曹兆龙，等.多索茶碱片在中国人的药代动力学研究[J].中国新药杂志，2000，9（6）：396.

[2]徐彦贵，卜一珊，何振梅，等.RP-HPLC法测定人血浆中多索茶碱浓度[J].中国药师，2002，5（8）：467.

[3]张 波，刘 艳，杜智敏，等.反相高效液相色谱法测定血浆中多索茶碱的浓度[J].哈尔滨医科大学学报，2004，38（1）：88.

[4]阚全程，李朵璐，师秀琴.HPLC测定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶碱浓度及其药动学研究[J].药物分析杂志，2009，29（5）：845.