国产与进口地塞米松棕榈酸酯注射液的人体生物等效性研究

朱艳荣，周伦，丁莉坤，赵培西，常瑛，冯娟，王婧雯，文爱东（第四军医大学西京医院药剂科，西安市710032）

地塞米松棕榈酸酯（Dexamethasone palmitate）为长效糖皮质激素类药，具有抗炎、抗过敏、抗休克及抗毒等作用，临床上可用于自身免疫性疾病、过敏性疾病、血液系统疾等的治疗[1]。制剂中以卵磷脂作乳化剂，将地塞米松棕榈酸酯溶解于乳糜微粒中，进入体内，乳糜微粒被巨噬细胞吞噬，使药物在病灶部位浓集；另一方面，地塞米松棕榈酸酯是由地塞米松与棕榈酸经酯化反应制得，在体内经酯酶作用缓慢水解，释放出活性物质地塞米松，从而起到持久的消炎作用和免疫抑制作用。在本研究中，笔者采用液-质联用（LC-MS）法测定人血浆中地塞米松棕榈酸酯和地塞米松的浓度，并将其应用于人体药动学及生物等效性研究中。

1 材料

1.1 仪器

1200液相色谱仪，包括真空脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱（美国Agilent公司）；6410三重四极杆串联质谱仪，包括MassHunter工作站（美国Agilent公司）；TDL80-2B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A涡旋仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）

1.2 试药

地塞米松对照品（批号：0129-9702）、泼尼松对照品（内标，批号：0199-9401）均为中国药品生物制品检定所提供；受试制剂：地塞米松棕榈酸酯注射液（西安力邦制药有限公司，规格：每支5 mg或10 mg，批号：070501）；参比制剂：地塞米松棕榈酸酯注射液（日本三菱制药株式会社，批号：P015）。甲醇为色谱纯，乙酸铵、二氯甲烷为分析纯；试验用水为去离子水。

2 方法[2]与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Akasil C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-10 mmol·L－1醋酸铵溶液（93.5∶6.5）；流量：1 mL·min－1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

检测方式：气动辅助电喷雾离子化（ESI）；离子极性：正离子；离子检测方式：多反应监测（MRM）；地塞米松棕榈酸酯：m/z631.4→373.3，碰撞能：25 eV，裂解电压：110 V；地塞米松：m/z393.3→147.3，碰撞能：25 eV，裂解电压：90 V；泼尼松：m/z359.3→147.2，碰撞能：25 eV，裂解电压：110 V。

2.2 研究对象选择

20名健康受试者被纳入试验。经体检证明肝、肾功能、心电图、血常规、尿常规、血生化检查均无异常后签署知情同意书。试验前2周及试验期间未服用任何其他药物。试验期间统一饮食。

2.3 剂量分组及给药方案

采用标准二阶段交叉设计（Two-period Crossover Design）自身对照试验方法，将20例受试者随机分为A、B组，第1阶段A组静脉注射受试制剂，B组静脉注射参比制剂，剂量均为单剂量静脉注射1 mL（4 mg）；经清洗期1周后2组交换给药品种进行第2阶段试验。试验期间禁止剧烈活动，禁止吸烟、饮酒或含药物、酒精的饮料等。每次试验前1天19∶00后即禁食。静脉注射药物前抽取空白血样5 mL，在给药后5、10、20、30 min及1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h时分别采静脉血5 mL置无菌肝素抗凝试管中，离心分离出血浆置无菌试管中，于－20℃保存，待测。

2.4 血浆样品的测定

2.4.1 血样处理：取含药血浆样品1 mL，加入内标（1 μg·mL－1泼尼松）溶液50 μL，涡旋混匀，再加入乙醚5 mL，涡旋3 min，于4 000 r·min－1离心10 min。取上清液于另一离心管中，于30℃水浴中氮气流吹干，流动相120 μL复溶。16 000 r·min－1离心3 min，取上清液转移至进样瓶中，进样分析。

2.4.2 特异性考察：在本试验所采用的色、质谱条件下，地塞米松、地塞米松棕榈酸酯、内标泼尼松的出峰时间分别为2.29、4.6、2.26 min。地塞米松棕榈酸酯、地塞米松和内标峰形良好，无杂峰干扰测定，表明本方法具有较高的特异性，灵敏度较高。液-质联用图谱见图1。

2.4.3 标准曲线：取10 mL塑料离心管数支，加入空白血浆1 mL，再分别加入不同量的地塞米松棕榈酸酯、地塞米松标准溶液，配成浓度分别为5.32、10.64、31.92、106.4、319.2、1 596 ng·mL－1的地塞米松棕榈酸酯以及 2.138、5.345、10.69、32.07、106.9、320.7 ng·mL－1的地塞米松含药血浆，并按“2.4.1”项下方法操作，复溶后吸取上清液转移至自动进样瓶中，进行分析。记录色谱图，分别记录地塞米松棕榈酸酯、地塞米松的峰面积As和内标峰面积Ai，计算峰面积的比值f（f＝As/Ai），将f对浓度（c）作权重回归，得地塞米松棕榈酸酯、地塞米松标准曲线方程分别为：f＝0.008 156c－0.015 261（r＝0.999 0）、f＝0.016 16c－0.008 24（r＝0.999 0）。结果表明，地塞米松棕榈酸酯、地塞米松血药浓度分别在5.32～1 596 ng·mL－1、2.138～320.7 ng·mL－1范围内线性关系良好。最低定量限（LLOQ）分别为5.32、2.138 ng·mL－1。

图1 液-质联用图谱A.空白血浆；B.地塞米松标准溶液；C.地塞米松棕榈酸酯标准溶液；D.内标溶液；E.地塞米松血浆样品；F.地塞米松棕榈酸酯血浆样品Fig1 LC-MS chromatogramsA.blank plasma；B.dexamethasone control；C.dexamethasone palmitate control；D.internal standard；E.dexamethasone plasma sample；F.dexamethasone palmitate plasma sample

2.4.4 精密度与回收率试验：取空白血浆1 mL，按“2.4.3”项下方法配制低、中、高3种浓度（地塞米松棕榈酸酯为10.64、53.2和532 ng·mL－1；地塞米松为5.345、32.07和213.8 ng·mL－1）的质量控制（QC）样品，各5个样本，连续测定3 d，测得地塞米松棕榈酸酯3种浓度的日内RSD＜14.56%，日间RSD＜7.55%，回收率分别为86.98%、85.37%、93.94%。测得地塞米松低、中、高3种浓度的日内RSD＜7.96%，日间RSD＜7.41%，回收率分别为81.43%、95.96%、83.78%。

2.4.5 稳定性试验 ：分别配成浓度为10.64、532 ng·mL－1的地塞米松棕榈酸酯血浆及浓度为5.345、213.8 ng·mL－1的地塞米松血浆各12份（n＝2），其中3份于配制好后立即按“2.4.1”项下方法操作；3份处理好的样品在室温放置6 h后按同法操作；3份于3次反复冻融后行稳定性测定；3份密封后放入冰箱中－20℃保存30 d后行稳定性测定。结果，地塞米松棕榈酸酯含量RSD为4.18%、6.19%；地塞米松含量RSD分别为5.7%、8.2%，表明样品在血浆中稳定。

2.5 药动学

20例受试者静脉滴注2种注射液后，地塞米松棕榈酸酯及地塞米松的药动学参数相近，平均药动学参数见表1。20例受试者静脉滴注2种注射液后平均药-时曲线见图2。

表1 20例受试者静脉滴注2种注射液后平均药动学参数（n＝20）Tab1 Mean pharmacokinetic parameters of 2 kinds of injections in 20 healthy volunteers with intravenous administration（n＝20）

图2 20例受试者静脉滴注2种注射液后平均药-时曲线（n＝20）A.地塞米松棕榈酸酯；B.地塞米松Fig2 Mean concentration-time curves of 2 kinds of injections in 20 healthy volunteers with intravenous administration（n＝20）A.dexamethasone palmitate；B.dexamethasone

将受试制剂和参比制剂的AUC及cmax经对数转换后，以双单侧t检验法进行生物等效性评价，结果表明上述2个参数无显著性差异（P＞0.05）；对2种地塞米松棕榈酸酯及地塞米松的tmax采用非参数Wilcoxon法统计，结果无显著性差异（P＞0.05）。表明受试制剂和参比制剂生物等效。

3 讨论

本试验采用LC-MS法测定血浆样品中地塞米松棕榈酸酯及地塞米松的浓度。所测定的药动学数据与报道相差不大，本方法快速、灵敏、专属性强、检测灵敏度高，可用于人体药动学及生物等效性研究。

[1]Yamamoto H，Fukuda M，Miyamoto Y，et al.A new trial liposteroid（dexamethasone palmitate）therapy for intractable epileptic seizures in infancy[J].Brain&Development，2007，299（7）：421.

[2]Yan YA，Hao LA.Simultaneous quantitation of dexamethasone palmitate and dexamethasone in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B，2008，862（1）：119.