LC-MS/MS法同时测定人血浆中对称性二甲基精氨酸和非对称性二甲基精氨酸的浓度

朱金辉，万丽丽，郭澄（上海交通大学附属第六人民医院药剂科，上海市200233）

对称性二甲基精氨酸（Symmetric dimethylarginine，SDMA）和非对称性二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一对同分异构体，主要来自于体内甲基化蛋白的水解，两者在体内发挥不同的生理调节作用。ADMA是一种内源性的一氧化氮合酶（NOS）抑制剂，可与精氨酸竞争性结合NOS活性部位，对调节一氧化氮合成和内皮功能起着非常重要的作用[1]。大量的临床研究证实，伴有内皮功能不全的心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭和糖尿病等患者的血中ADMA水平均有显著增加，且ADMA水平的升高与心血管事件的发生率和病死率呈明显正相关[2]。而SDMA虽然对NOS没有作用，但是能够反映肾功能的变化，是肾小球滤过率变化的一个早期标志物[3]。因此，无论从试验角度还是临床需求，都需要建立一种快速、简便、准确测定血液中ADMA和SDMA的方法。由于ADMA和SDMA的化学性质十分接近，以往的文献报道，在样品处理时大多采用加入衍生化试剂对两者进行色谱分离以后再测定，步骤烦琐、费时[4]。近几年，随着质谱技术的发展，有研究表明[5]，可利用ADMA和SAMA各自的特征碎片离子峰同时检测其浓度，免去了色谱分离的步骤，简化了样品处理过程，适用于临床大规模样本的检测。本研究在此基础上对方法作了进一步的优化。

1 材料

1.1 仪器

Agilent QQQ液相色谱/质谱联用仪，包括G1311A型四元输液泵、G1322A型脱气机、G1367B型自动进样器、G1316A型柱温箱、G6410B型三重串联四极杆质谱、电喷雾源和Mass-Hunter工作站（美国Agilent公司）；Millipore Simplicity 185型超纯水系统（法国Millipore公司）；Vortex Genie 2型涡旋混悬器（美国Vortex公司）；TG16-WS台式高速离心机（中国湘仪公司）。

1.2 试药

SDMA对照品（批号：D00085051，纯度：＞98.0%）、ADMA对照品（批号：D00069835，纯度：＞98.0%）均采购自美国Sigma公司；内标：氢溴酸右美沙芬对照品（批号：100201-200502，纯度：94.9%）购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲酸、甲酸铵为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Thermo Hypercarb柱（50 mm×4.6 mm，5 μm）；Zorbax SB-C8保护柱（2.1 mm×12.5 mm）；流动相：乙腈∶甲酸铵-甲酸缓冲溶液（5 mmol·L－1甲酸铵，0.1%甲酸）（梯度洗脱程序见表1）；流速：0.40 mL·min－1；分析时间：8 min；进样量：5 μL；柱温：35℃。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab1 Gradient elution process of mobile phase

电喷雾电离源（ESI源），雾化气（N2）压力：35 psi；干燥气（N2）流速：10 mL·min－1；干燥气温度：350 ℃；正离子方式检测；毛细管电压：3 500 V；扫描方式：多反应监测（MRM）。MRM检测参数见表2。ADMA、SDMA的二级质谱见图1。

表2 MRM检测参数Tab2 MRM parameters for the detection

图1 二级质谱图A.ADMA；B.SDMAFig1 MS2 spectrumA.ADMA；B.SDMA

2.2 溶液的配制

2.2.1 SDMA贮备液：准确称取SDMA对照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为500 μg·mL－1的SDMA标准贮备液，4 ℃保存备用。

2.2.2 ADMA贮备液：准确称取ADMA对照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为500 μg·mL－1的ADMA标准贮备液，4 ℃保存备用。

2.2.3 工作溶液：取SDMA和ADMA贮备液适量，以水稀释，制备成相当于浓度为0.5、1、2、2.5、5、10 mg·mL－1的系列混标溶液。

2.2.4 内标溶液：准确称取氢溴酸右美沙芬对照品适量，以乙腈溶解，配制成浓度为50 ng·mL－1的内标溶液。

2.3 血浆样品处理

精密吸取待测血浆100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入300 μL含内标右美沙芬50 ng·mL－1的乙腈溶液，涡旋30 s，13 000 r·min－1离心6 min，取上清液5 μL进样分析。

2.4 标准曲线的制备

取空白血浆100 μL，加混标溶液5 μL，制成相当于SDMA和ADMA浓度均为25、50、100、125、250、500 ng·mL－1的模拟血浆样品，按“2.3”项下方法操作，建立标准曲线。以待测物的浓度（X）为横坐标，对照品与内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，同时将5份空白血浆中的峰面积比值取均值，作为背景扣除后，进行线性回归运算，求得线性回归方程分别是：YSDMA＝0.005 2XSDMA+0.038 8（r＝0.999 8）、YADMA＝0.005 8XADMA+0.063 5（r＝0.995 3）。结果表明，SDMA和ADMA血药浓度均在25～500 ng·mL－1范围内线性关系良好，方法的定量下限均为25 ng·mL－1，RSD分别为6.36%和5.70%。

2.5 准确度及精密度试验

取空白血浆100 μL，分别加入不同浓度的混标溶液5 μL，按“2.3”项下方法制成低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3种浓度的质控样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3 d，并随行标准曲线，以当日的标准曲线计算标准样品的浓度，分别求算方法回收率和日内、日间精密度，结果见表3。

表3 回收率及精密度试验结果（n＝6）Tab 3Results of recovery and precision tests（n＝6）

2.6 基质效应考察

取空白血浆100 μL，除使用不含内标的乙腈沉淀蛋白外，其他按“2.3”项下方法操作后，用获得的上清液中加入低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3种浓度的质控样品和内标溶液，进样获得峰面积；同样以水代替空白血浆进行相同处理，获得峰面积。比较2种处理方式下，用3种化合物的峰面积之比评价基质效应。SDMA和ADMA比值在105%～120%，内标的比值在90%～95%。结果表明，本方法不受基质效应的影响。

2.7 稳定性考察

取空白血浆100 μL，分别加入不同浓度的混标溶液5 μL，按“2.2.3”项下方法制成低、中、高（37.5、100、375 ng·mL－1）3种浓度的质控样品，按“2.3”项下方法进行处理和测定，分别考察SDMA和ADMA血浆样品（未处理）室温放置4 h，4℃放置24、48 h，处理后室温放置24 h，3周期冻融试验和－20℃冷冻放置1、2、4周的稳定性。结果，未处理的样品在以上保存条件下测得的相对误差（RE）均在±10%之内，RSD均＜15%；处理后24 h内RE在±4.62%之内，RSD＜4.8%，表明血浆样品在上述条件下稳定性良好。

3 讨论

在对SDMA和ADMA进行质谱分析时发现，二者在色谱柱上的保留行为十分相似，出峰时间一致。二者且拥有几乎相同的碎片离子峰，但其中有2个碎片离子峰却是各自所特有的：m/z203.1→172.1（SDMA）与m/z203.1→46.1（ADMA）。对20 ng·mL－1对照品进样的结果显示，信噪比分别是69和58，可用于定量分析。ADMA和SDMA的碎片离子峰见表4。

本方法所用的色谱柱为Thermo公司的Hypercarb柱，填料为石墨炭（Graphitic carbon），对比Agilent的C18柱和苯基柱，Hypercarb柱对SDMA和ADMA的响应更好，以20 ng·mL－1对照品为例，其响应值是苯基柱的10倍。保留时间C18柱在0.5min就出峰，易受血浆中其他物质的干扰；Hypercarb柱的保留时间在1.9 min，特异性较高，受基质效应影响小。

表4 ADMA和SDMA的碎片离子峰Tab4 Fragment ion peak ofADMAand SDMA

对于内标的选择，国外文献通常采用同位素内标，能够直观地解决稳定性、特异性等问题，但价格比较昂贵，用于常规检测显然成本过高。而SDMA、ADMA的同系物几乎都是内源性的物质，也不可采用。因此，笔者在内标的选择上花费了一定时间，最后选择的右美沙芬符合内标的要求，对SDMA和ADMA的检测无干扰。

ADMA作为一个NOS的内源性抑制剂，在近几年得到了越来越多的关注，相当数量的临床研究证实了ADMA在心血管疾病发生、发展中所扮演的重要角色[6]。对于ADMA如何应用于疾病的预防及药物对其的干预作用，目前尚处在研究中，但是一个快速、准确的血浆浓度测定方法无论对于临床研究还是科研探索都是必要的手段。

[1]Boger RH.Asymmetric dimethy larginine（ADMA）：Anovel risk marker in cardiovascular medicine and beyond[J].Ann Med，2006，38（2）：126.

[2]Anderssohn M，Schwedhelm E，Böger RH，et al.Asymmetric dimethylarginine as a mediator of vascular dysfunction and a marker of cardiovascular disease and mortality：an intriguing interaction with diabetes mellitus[J].Diab Vasc Dis Res，2010，7（2）：105.

[3]Jan T，Hendrik V，Jens Martens，et al.SDMA is an early marker of change in GFR after living-related kidney donation[J].Nephrol Dial Transplant，2011，26（1）：324.

[4]Horowitz JD，Heresztyn T.An overview of plasma concentrations of asymmetric dimethylarginine（ADMA）in health and disease and in clinical studies：Methodological considerations[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，851（1）：42.

[5]Gary W，Bernard F，Michael P，et al.Arginine and methylated arginines in human plasma and urine measured by tandem mass spectrometry without the need for chromatography or sample derivatisation[J].Journal of Chromatography B，2008，874（1）：27.

[6]De Gennaro Colonna V，Bianchi M，et al.Asymmetric dimethylarginine（ADMA）：an endogenous inhibitor of nitric oxide synthase and a novel cardiovascular risk molecule[J].Med Sci Monit，2009，15（4）：RA91.