重组人骨形态发生蛋白-2原核表达及单克隆抗体制备

王 婧，张 杰，张 颖，马宁宁，谢良志

1中国医学科学院 北京协和医学院 细胞工程中心，北京 100005

2神州细胞工程有限公司，北京 100176

骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)是转化生长因子β超家族的成员，是广泛分布于动物骨组织的酸性蛋白质，在修复骨质缺损和促进骨折愈合、造血系统分化、神经发育和修复等方面发挥重要作用［1］。其中BMP-2诱导成骨的活性最强，是骨骼系统形成和正常发育所必不可少的因子。重组人骨形态发生蛋白2的成熟肽 (recombinant human bone morphogenetic-2 mature peptide，rhBMP-2m)已经被美国FDA批准用于骨质损伤、额面修复及脊椎融合，因此rhBMP-2m具有广泛的临床应用前景。目前，国内外关于rhBMP-2m及其单克隆抗体的生产一直受到工艺的限制不适合其推广应用，如复性困难、工艺难以放大等。本研究利用简单的原核表达系统 (E.coli)获得具有生物学活性的rhBMP-2m并制备能检测真核细胞表达rhBMP-2m的单克隆抗体，为rhBMP-2m研究和商业化生产奠定基础。

材料和方法

材料 雌性Balb/c小鼠 (北京维通利华实验动物技术有限公司);辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(北京义翘神州生物技术有限公司);小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心);SP琼脂糖凝胶FF填料、反相层析 SOURCE30填料 (美国 GE公司);Tris-HCl、NaCl、尿素、尼克酸等化学试剂 (上海生工生物工程有限公司);大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m、瞬时转染的 pSTEP-rhBMP-2/293细胞株、转染试剂盒 (北京义翘神州生物技术有限公司)。高压均质仪 (加拿大 ATS工业系统有限公司);7L磁力搅拌罐 (上海保兴生物设备工程有限公司);高效高速冷冻离心机、台式高速离心机 (美国贝克曼库尔特有限公司)。

BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m发酵 取－70℃保存的BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m工程菌株，划LB琼脂平板，含30 mg/L卡那霉素，37℃培养20 h。挑取单菌落接种到2 ml MDG培养基中，培养过夜。然后以2%接种量转接到10 ml MDG中，培养8 h后，以此为种子接种到5L含有ZYM-5052培养基的发酵罐中，37℃，450 r/min搅拌，pH值7.0，培养过夜。收菌前取1 ml菌液，离心收集菌体细胞并超声破碎，用13%还原SDS-PAGE检测rhBMP-2m成熟肽的表达量及可溶性。在此以及之后的步骤中，所有SDSPAGE结果均使用BandScan软件分析。

包涵体的分离、溶解、纯化及复性 将培养过夜的菌液以6500 r/min，最小半径119 mm，最大半径222.8 mm，倾角20°，离心8 min，收集菌体，用细胞裂解液 (1 mmol/L EDTA、1%TritionX-100、1%Tween20、20 mmol/L Tris、pH 9.0)悬浮，高压均质仪破碎。破碎液以6500 r/min，最小半径119 mm，最大半径222.8 mm，倾角20°，离心40 min，弃去上清，收集沉淀，分离得到粗制包涵体。

粗制包涵体进一步使用含有0.5 mol/L尿素的细胞裂解液洗涤第2次，6500 r/min，最小半径119 mm，最大半径222.8 mm，倾角20°，离心40 min收集沉淀。之后，包涵体用溶解缓冲液 (8 mol/L尿素、50 mmol/L Tris、pH8.0)溶解过夜，第2天13000 r/min，最小半径25 mm，最大半径97 mm，倾角25°，离心10 min，收集上清并使用0.22 μm醋酸纤维膜过滤。

变性后的rhBMP-2m使用阳离子柱SP-Sepharose FF(1.6 cm×15 cm)分离纯化。上样前使用缓冲液A(8 mol/L尿素、50 mmol/L Tris、pH7.0)平衡，使用含有1 mol/L NaCl的缓冲液A线性洗脱，每10毫升体积收集一管洗脱液，待SDS-PAGE分析后合并纯度较高的洗脱蛋白组分。洗脱组分通过直接稀释到含有0.75 mol/L尼克酸复性缓冲液，去除变性剂达到复性效果［1］。复性后的蛋白样品使用RPCSource30(1.1 cm×15 cm)分离纯化，上样前使用含有1‰三氟乙酸的去离子水平衡，使用同样含有1‰三氟乙酸的乙腈线性洗脱。合并rhBMP-2m同源二聚体含量相当组分，得到样品Ⅰ和样品Ⅱ。

重组人BMP-2成熟肽活性测定 根据文献［2］，小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1在rhBMP-2m刺激培养下向成骨细胞转化，特征性产生碱性磷酸酶。本研究采用含有rhBMP-2m浓度分别为10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.063、0 ng/ml的条件培养基培养MC3T3-E1细胞，通过测定每个培养条件下的碱性磷酸酶活性变化分析rhBMP-2m的生物学活性，进行3次平行实验。

以每孔2×104个细胞/孔接种 MC3T3-E1于96孔细胞培养板中，在含有10%FBS α-MEM培养基中培养48 h，随后换不含FBS的培养基继续培养24 h，之后换含有1%FBS的条件培养基 (即含有不同浓度rhBMP-2m)刺激培养72 h。最后，吸去培养上清，使用事先预冷的PBS洗板两次，然后每孔中加入100 μl含有10 mmol/L对硝基苯磷酸二钠盐的裂解液，37℃反应30 min，加入1 mol/L NaOH终止反应，在405 nm波长处测定样品所吸收的光密度值。

重组BMP-2成熟肽单克隆抗体的制备 用复性纯化得到的rhBMP-2m样品Ⅰ免疫小鼠，单克隆抗体制备具体过程参照《细胞与分子免疫学实验技术》第二章［3］。

免疫印迹鉴定 将复性纯化得到的rhBMP-2m样品Ⅰ进行还原及非还原SDS-PAGE电泳，用半干转方法将凝胶蛋白带转移到聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清蛋白封闭过夜，加入单克隆抗体，室温2 h后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠 IgG，最后使用辣根过氧化物酶特异性底物DAB显色。同样的方法，使用pSTEP-rhBMP-2瞬时转染的293细胞裂解液鉴定所获得单克隆抗体的特异性。

结 果

rhBMP-2m的诱导表达 工程菌BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m进行自诱导发酵，发酵液体积为5 L，收样前取样检测其在600 nm处的光密度值为13。13% 还原SDS-PAGE电泳分析 (图1)，诱导后全菌在相对分子质量约13000处有一条高表达的蛋白条带，约占全菌蛋白的40%，破菌后80%以上目的蛋白以不溶解的包涵体形式存在。

rhBMP-2m包涵体溶解、纯化及复性结果 SDS-PAGE电泳结果显示，在300～450 mmol/L NaCl间洗脱样品纯度达到90%(图2)。取该样品进行稀释复性，复性率达到75%，即在非还原SDS-PAGE中显示复性后二聚体的含量占总蛋白量的75%。复性后样品浓度小于0.1 mg/ml，纯度约70%。

复性后样品使用反相层析纯化目的蛋白主要在30%～45%乙腈浓度下获得。纯化后获得两组样品，样品Ⅰ浓度为0.7 mg/ml，二聚体占蛋白总量的85%以上;样品Ⅱ浓度为0.28 mg/ml，二聚体占蛋白总量的40%(图3)。两组样品在还原性SDS-PAGE结果中显示纯度均大于95%。在其后的rhBMP-2m单克隆抗体制备及免疫印迹鉴定实验中所使用的样品均为样品Ⅰ。

图1 rhBMP-2m诱导表达及可溶性还原电泳分析Fig 1 Reduced SDS-PAGE analysis of rhBMP-2m induced expression and its dissolubility

图2 变性rhBMP-2m阳离子层析柱纯化结果还原电泳分析Fig 2 Reduced SDS-PAGE analysis of denatured rhBMP-2m purified by cation exchange chromatography

rhBMP-2m活性鉴定结果 复性纯化后获得的rhBMP-2m样品Ⅰ和Ⅱ在40～5000 ng/ml均表现出生物学活性，随着rhBMP-2m的浓度增加，MC3T3-E1细胞产生的碱性磷酸酶活力呈对称S形曲线增长。在相同rhBMP-2m浓度下，MC3T3细胞中样品Ⅰ诱导产生的碱性磷酸酶活性比样品Ⅱ诱导产生的碱性磷酸酶活性高 (图4)。

图4 诱导MC3T3-E1中碱性磷酸酶活性鉴定样品Ⅰ和Ⅱ的生物学活性Fig 4 Biologic activities of samplesⅠandⅡ were measured by the induction of alkaline phosphatase activity in MC3T3-E1 cells

单克隆抗体的获得及鉴定 共筛选得到2株rh-BMP-2m单克隆抗体，分别命名为MM01H和MM03H。采用rhBMP-2m样品Ⅰ进行免疫印迹分析，还原SDS-PAGE条件下免疫印迹结果显示MM01H和MM03H均在相对分子质量13000处杂交出特异性条带，相对分子质量与rhBMP-2m单体相符合;非还原SDS-PAGE条件下免疫印迹结果显示MM01H和MM03H均在相对分子质量26000处杂交出特异性条带，相对分子质量与rhBMP-2m二聚体相符合(图 5)。

图5 免疫印迹分析MM01H单抗和MM03H单抗对抗原的识别Fig 5 Western blot of antigen using MM01H antiboy and MM03H antibody

采用瞬时转染 (转入pSTEP-rhBMP-2质粒)的293细胞裂解液进行免疫印迹分析，结果显示两株单克隆抗体在相对分子质量50000～55000杂交出清晰的条带，相对分子质量与糖基化的全长rhBMP-2(396aa)单体相符合。其中单克隆抗体MM03H免疫印迹结果显示在相对分子质量18000附近出现杂交条带，相对分子质量与糖基化修饰的rhBMP-2成熟肽单体相符合 (图6)。

图6 免疫印迹分析MM01H单抗和MM03H单抗对表达人骨形态发生蛋白-2全长基因的瞬时转染293细胞裂解液的识别Fig 6 Western blot of expressing total gene of human morphogenetic protein-2 transient transfection 293 cells lysate using MM01H and MM03H

讨 论

人BMP-2的cDNA编码区全长1188bp，编码396个氨基酸，相对分子质量约45000，基因定位于染色体20p-12。经翻译形成前体蛋白，酶切去氨基端的信号肽、前肽后，得到由114个氨基酸组成的成熟肽，相对分子质量约13000。人BMP-2成熟肽包括7个半胱氨酸，其中6个形成分子内二硫键，1个形成分子间二硫键，成熟肽的同源或异源二聚体BMP-2才具有生物活性［1］。使用Vector NTI Suite9软件分析其结构，结果显示rhBMP-2m具有较强的疏水性。本研究用E.coli工程菌株表达出人BMP-2成熟肽段 (rh-BMP-2m)，80%目的蛋白以包涵体形式存在，表明rhBMP-2m包涵体经复性形成具有生物学活性的rh-BMP-2m二聚体非常困难。相对真核表达系统，原核表达系统具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高、培养周期短等特点。因此，在解决蛋白复性的基础上，原核表达系统表达生产rhBMP-2m是能够将治疗性rhBMP-2m推向临床应用的良好途径。

第四军医大学陈苏民课题组［4］采用透析法复性，虽然复性过程中目的蛋白浓度可以达到6 mg/ml，但是其中只有1/3的目的蛋白形成rhBMP-2m二聚体，且该课题组得到的rhBMP-2m细胞生物学活性的最低浓度仅为2μg/ml。同时，采用透析法复性在工艺放大时有一定的局限性。Yano等［5］和 Long等［6］的研究显示具有生物学活性的rhBMP-2m最低浓度为30～50 ng/ml。但是文献 ［5-6］中提供的复性方法具有相同的缺点，即复性过程复杂 (一般在稀释复性后还需要经过至少两步换液)、最终样品浓度极低 (＜20μg/ml)、稳定性差 (在浓缩过程中容易沉淀)。

本研究采用简单的稀释复性法获得了具有生物学活性的rhBMP-2m，虽然rhBMP-2m在复性后纯度有所减低，分析原因可能是复性过程中一些错误折叠使rhBMP-2m有不同的构象。复性后样品经一步纯化即可得到高纯度和高浓度rhBMP-2m蛋白样品。其中rhBMP-2m二聚体占总蛋白量85%以上的样品Ⅰ在40 ng/ml时即表现出生物学活性，复性后样品中正确折叠的二聚体含量与蛋白生物学活性密切相关。本研究采用的工艺，复性缓冲液成分简单、纯化成本低、稳定性好，成功解决了复性困难、复性后样品难浓缩等难题，容易放大到规模化生产。

关于rhBMP-2m的单克隆抗体制备目前报道较少，分析原因可能为免疫的抗原难以制备，同时BMP-2m各物种间高度保守，免疫原性弱，只有轻微的免疫刺激能力［7］。本研究通过原核表达 (E.coli)，复性获得具有生物学活性的rhBMP-2m作为抗原免疫小鼠，并用于抗体筛选，最终获得两株结合力强、特异性良好的单克隆抗体 (图5)。获得的单克隆抗体可用于建立rhBMP-2m的检测方法，用于检测其他表达系统的表达量，筛选高表达的细胞株。

瞬时转染 (转入pSTEP-rhBMP-2质粒)的293细胞裂解液免疫印迹显示，rhBMP-2在前体蛋白显色位置在相对分子质量为50000～55000，比理论相对分子质量45000高，是由于rhBMP-2前体蛋白被糖基化，即糖基化发生在其剪切成为成熟肽之前。笔者推测，这种糖基化可能发挥稳定蛋白结构的作用，对rhBMP-2m向细胞外分泌及活性具有重要的意义。

综上，本研究的重要意义是:(1)为今后建立E.coli表达rhBMP-2m规模化生产工艺奠定基础;(2)获得具有结合力强、特异性好的单克隆抗体，为进一步研究生理条件下BMP-2相关疾病的发生提供检测方法;(3)建立抗体检测方法，为rhBMP-2m在其他表达体系中的研究提供监测手段。

［1］Vallejo LF，Brokelmann M，Marten S，et al.Renaturation and purification of bone morphogenetic protein-2 as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli［J］.Biotechnology，2002，94(2):185-194.

［2］Kawazoe Y，Shiba T，Nakamura R，et al.Induction of calcification in MC3T3-E1 cells by inorganic polyphosphate ［J］.J Dent Res，2004，83(8):613-618.

［3］金伯泉.细胞与分子免疫学实验技术［M］.西安:第四军医大学出版社，2002:9-16.

［4］王馥丽.高浓度rhBMP-2m复性条件的探讨［D］.西安:中国人民解放军第四军医大学，2005.

［5］Yano K，Hoshino M，Ohta Y，et al.Osteoinductive capacity and heat stability of recombinant human bone morphogenetic protein-2 produced by Escherichia coli and dimerized by biochemical processing［J］.J Bone Miner Metab，2009，27(3):355-363.

［6］Long S，Truong L，Bennett K，et al.Expression，purification，and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Escherichia coli［J］.Protein Expr Purif，2006，46(2):374-378.

［7］安新玲，韩金祥，王世力.骨形态发生蛋白的研究进展［J］.食品与药品，2009，11(11):69-72.