猪TPST1基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建
2011-08-08孙洪涛张冬杰
别 墅,孙洪涛,张冬杰,汪 亮,刘 娣,*
(1.东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨 150030;2.黑龙江省农业科学院,哈尔滨 15008)
硫酸化是蛋白质中的酪氨酸残基翻译后而进行的加工过程,起修饰作用[1],硫化后的酪氨酸是蛋白质与蛋白质结合、白细胞粘附的重要决定因子[2]。此反应受到高尔基体酶-酪氨酸硫化转移酶(Tyrosyl-protein sulfotransferase, TPST)的 调 节 ,TPST为膜内蛋白,其活性中心朝向高尔基复合体腔,广泛存在于大多组织细胞中[3]。作用是将与二磷酸腺苷相结合的带负电荷的硫基团,转移给酸性氨基酸附近的酪氨酸残基[4]。有关TPST基因功能的研究较少,有报道炎症刺激会影响TPST的转录[5]。本研究采用电子克隆结合RT-RCR的方法,首次克隆和分析了猪的TPST1基因的完整序列,成功构建了TPST1基因的真核表达载体,为进一步分析该基因功能、遗传标记及细胞功能提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
民猪3头,采集背肌组织样,迅速冻于液氮里带回实验室,-80℃保存备用。
1.2 RNA提取及cDNA合成
使用Invitrogen公司的Trizol kit分别提取各组织的总RNA,然后按照TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit操作手册,使用该试剂盒将所提取的各组织RNA反转录成cDNA。
1.3 引物设计与真核表达载体构建
应用BLAST(Blastp,TBlastX,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上执行序列同源性搜索,寻找其他物种已有的TPST1相关核酸序列,进行序列比对。在高度相似区(NM_003596.3)设计了1对引物用于 RT-PCR 扩增。F1:5′(HindⅢ)AAGCTTAT GGTTGGAAAACTGAAGCAG 3′,R1:5′(Bam HⅠ)GGATCCTGTTCTACAAAACATTAGAACATGT3′。以民猪背肌cDNA为模板降落式RCR进行扩增,94℃ 10 min,94℃ 30 s,64℃ 30 s,-1℃/cycle,72 ℃ 2 min,go to 2,16 cycles,94 ℃ 30 s,48 ℃30 s,72 ℃ 2 min,go to 6,15 cycles,72 ℃ 10 min,4℃ forever。扩增出特异片段经纯化后连入pMD18-T sample载体,转化入大肠杆菌后,涂于含有Amp的LB固体培养基上过夜培养,培养结束后,挑选阳性克隆菌落提质粒,双酶切(Bam HⅠ/HindⅢ)鉴定后,送上海生工测序。确定序列正确后与pcDNA3.1(+)表达载体质粒分别用限制性Bam HⅠ/HindⅢ内切酶酶切,回收纯化后,使用T4DNA ligase 16℃过夜连接,连接产物转化到大肠杆菌DH5α中,提取质粒,酶切鉴定并测序。
1.4 分子进化树的构建
从NCBI数据库检索到的人、大鼠、小鼠、牛、原鸡等10种动物的TPST1基因与克隆的猪TPST1基因进行多重序列比对,构建分子进化树。
1.5 生物信息学分析
应用DNAStar 5.0软件的ClustalW对包括猪在内的其他物种的TPST1基因序列进行比对分析;利用Lasegene的protean分析TPST1蛋白质的二级结构;应用MEGA3.0软件构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 民猪TPST1基因克隆测序
以民猪的背肌cDNA为模板,扩增出1 543 bp片段序列(见图1)。
图1 猪TPST1 cDNA PCR扩增产物电泳Fig.1 Electrophoresis of porcine TPST1 cDNA PCR product
利用DNAstar软件预测其完整的CDS长度为1 113 bp,其起始码子为ATG,终止密码子为TAG,编码370个氨酸,蛋白质的理论等电点(pI)为9.0,相对分子质量为42.13 ku,多肽链含有50个强碱性氨基酸残基,40个强酸性氨基酸,129个疏水性氨基酸残基,80个极性氨基酸残基(见图2)。
图2 猪TPST1基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence of porcine TPST1 and the deduced amino acid sequence
2.2 真核表达载体结果分析
将该序列与pcDNA3.1(+)表达载体连接后,成功提取到质粒,双酶切鉴定和测序结果证明真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-TPST1构建成功,结果见图3。
2.3 同源性及分子进化分析
应用ClustalW软件将猪与另外10个物种TPST1氨基酸序列进行比对分析发现,与牛(97.6%)、小鼠(96.8%)、大鼠(97%)、人(97.03%)等物种均具有较高的一致性。MEGA3.0软件对TPST1蛋白质的物种间系统进化树分析亦表明猪与大鼠、人、猕猴、猩猩亲缘关系较近位于第一个分支,马和原鸡与其亲缘关系较远属于另一个分支(见图4)。
图3 pcDNA3.1(+)-TPST1载体双酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid of pcDNA3.1(+)-TPST1
图4 TPST1基因的物种间系统进化树分析Fig.4 Analysis of phylogenetic relationship of TPST1 gene among species
3 讨论与结论
1998年人的TPST1 cDNA序列被克隆出来,包含370个核苷酸,是一种糖蛋白内有两个N-连接的糖基化位点,没有O-连接的糖基化位点[7]。研究者们发现在有机体的总蛋白中约有1%的酪氨酸残基被硫酸化,
此修饰影响分泌型蛋白的细胞内转运和一些神经肽的生物学活性[8]。酪氨酸硫酸化具有高度的选择性,能识别含有酸性氨基酸、酪氨酸暴露的蛋白质区域,可增强酪氨酸硫化转移酶与其作用的亲和力[3]。TPST1翻译后受到酪氨酸硫化修饰的调节,硫化抑制剂shRNA可以显著抑制TPST的活性[2]。李传友等发现TPST基因在植物根尖干细胞维持中起重要作用[9],也研究表明TPST基因能够调控植物的生长发育,在动物的许多生理及病理过程中起着非常重要的作用,如激素调节、生理止血、炎症、感染性疾病等。
经分析猪TPST1基因其完整的CDS长度为1 113 bp,编码370个氨基酸,蛋白质的理论等电点(pI)为9.0,相对分子质量为42.13 ku,多肽链含有50个强碱性氨基酸残基,40个强酸性氨基酸,129个疏水性氨基酸残基,80个极性氨基酸残基,酪氨酸为12个。构建进化树分析,民猪TPST基因的编码的氨基酸序列相对保守,与人、鼠、牛、犬、猩猩都具有较高的一致性96%以上,属于第一个分支;与原鸡、马亲缘关系较远一致性在88%左右。
本研究首次克隆获得1 543 bp的民猪TPST1基因并登录NCBI(HQ439987),其完整的CDS长度为1 113 bp。在此基础上成功构建pcDNA3.1(+)-TPST1重组质粒,为后续试验研究TPST1基因调节酪氨酸硫酸化的作用机制,及在东北民猪的生长发育、抗炎症、抗逆等性状研究方面有着十分重要的意义。
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