民猪群体氟烷基因频率检测及序列多态性分析

魏 巍，王希彪，黄宣凯，张 野，兰晓明，刘建明，暴 国

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

1991年Fujii发现猪应激综合症（Porcine stress syndrome,PSS）是兰尼定受体基因（Ryanodine recetor gene RYR1）突变所致[1]，此突变是隐性突变，并认为此突变基因即为氟烷隐性基因（Haln）。PSS易导致猪应激而突然死亡或产生PSE肉[1]，给养猪业造成巨大的经济损失，美国每年约损失2.3～3.2亿美元[2]。研究表明Haln基因对猪的胴体性状呈加性效应[3]，可使猪胴体重增加2%～3%，但又会减少窝产仔数和增加PSE肉的发生率[4-5]。

我国地方猪种携带Haln基因较少，李来记报道的二花脸猪Haln基因的频率为0.57%、民猪Haln基因的频率为15.62%、五指山和香猪Haln基因的频率为0；陈蕴颖等报导的内江猪、版纳猪和五指山小耳猪Haln基因的频率也为0；方美英报道的姜曲海猪、内江猪、桃园猪和香猪Haln基因的频率为0，民猪Haln基因的频率为10%[6-8]。近年来对中国地方猪种Haln基因的研究，越来越多的采用测序的方法，如赵中权等分析了藏猪Haln基因序列及其多态性[9]；李来记等对二花脸、香猪MHS基因的DNA序列进行了比较[10]；帅素容等分析了内江猪、太湖猪、成华猪和雅南猪Haln基因序列并与国外猪种做了对比分析[11]，而民猪在此方面的研究一直未见报道。民猪具有抗逆性强、肌内脂肪含量高、肉质优良、高繁殖力等优点，其优良特性引起海内外的重视[12]，在世界地方猪种排行榜中名列第四位[13]，2000年将其列入国家畜禽品种保护名录[14]。因此本文对Haln基因在民猪群体中的分布进行了检测并测定了民猪Haln基因的序列，为合理利用Haln基因和民猪选种选配提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样品采自黑龙江省兰西县民猪保种基地，共48头民猪个体。另外还查找了国内外不同品种猪Haln基因的相同区段，序列来源与编号见表1。

表1 试验样品或序列来源Table 1 Source of experimental samples or sequences

1.2 方法

1.2.1 取样

用耳号钳采集少量耳组织，装入盛有75%酒精的离心管中，带回实验室-20℃保存备用。

1.2.2 DNA提取

1.2.2.1 配制裂解液

试验用裂解液为本实验室改良的配方，100 mL猪耳组裂解液的配制方法如下：1 mol·L-1Tris-Cl（pH 8.0）5 mL，0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）20 mL，2 mol·L-1NaCl 5 mL，10%SDS 10 mL，1%Pr-k 1 mL。

1.2.2.2 基因组DNA的提取

蒸馏水清洗耳组织并剪碎→55℃过夜消化耳组织→加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1混合液，颠倒萃取20 min→4 ℃，7 500 r·min-1离心10 min，取上清液至一干净的1.5 mL离心管中→加入等体积的酚：氯仿∶异戊醇=25∶24∶1混合液，颠倒萃取20 min→4 ℃，7 500 r·min-1离心10 min，取上清液至一干净的1.5 mL离心管中→加入等体积的氯仿∶异戊醇=24∶1混合液，颠倒萃取20 min→4℃，7 500 r·min-1离心10 min，取上清液至一干净的1.5 mL离心管中→加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃放置30 min→4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min，弃上清→加入2倍体积的预冷的75%乙醇，4℃，12 500 r·min-1离心5 min；弃上清→晾干后，加入100 mL 0.1×TE，55℃溶解DNA→-20℃保存备用。

1.2.2.3 基因组DNA的检测

用1.0%Agarose凝胶电泳检测DNA的完整性，用紫外分光光度计测定其在OD260和OD280的光度值，通过OD260/OD280计算原液的纯度，通过OD260×稀 释 倍 数 ×50（ng·mL-1）计 算 原 液 浓度，-20℃保存DNA原液。

表2 引物序列、退火温度及目的片段大小Table 2 Sequences,annealing temperature and size of motive frag

1.2.3 Haln基因的PCR扩增

引物序列采用Fujii等的研究成果[1]，由上海生物工程技术服务有限公司合成，具体信息见表2。

PCR扩增反应液（25 μL）组成如下：基因组DNA（100 ng·μL-1）2 μL，dNTP（2.5 mmol·mL-1） 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Haln-613-F（10 pmol·mL-1）1 μL，Haln-613-R（10 pmol·mL-1）1 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.4 μL，加水补足至25 μL。PCR反应程序：95℃ 5 min，30×(95℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃45 s，72℃10 min，4℃保存。取PCR产物于1.2%Agarose凝胶电泳，切取600 bp左右处的片段，回收纯化目的DNA，送至上海生物技术服务有限公司测序。

1.2.4 酶切

采用Hha Ι内切酶对扩增的Haln基因613 bp片段进行酶切，酶切反应体系组成如下：Hha Ι（10 U·μL-1）限制性内切酶 0.35 μL，10×buffer 2 μL，PCR产物5 μL，ddH2O补足至10 μL。酶切反应条件：37℃水浴4 h[16]。酶切产物用1.2%Agarose凝胶电泳，GoldView（GD）染色、凝胶成像仪成像拍照分析。

1.3 统计分析

用BioEdit等软件分析所测样本的序列，并与其他10个品种（系）的Haln基因相比寻找突变位点。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果

从猪耳组中提取的基因组DNA浓度约为2 735 ng·μL-1，其纯度在1.7～1.9范围之内，1%Agarose凝胶电泳图谱中观察，是一条光滑整齐的条带（见图1）。

图1 DNA电泳图谱Fig.1 Electrophoresis pattern of DNA

2.2 Haln-PCR扩增结果

经PCR特异性扩增的目的片段全长为613 bp，由电泳图谱可见无杂带（见图2）。

2.3 Haln-Hha I酶切结果

结果见图3。

PCR产物经限制性内切酶Hha Ι消化获得的Haln基因座位3种基因型的特征带型为：HalNHalN（NN）为500 bp和113 bp 2条带；HalNHaln（Nn）613 bp、500 bp和113 bp 3条带；HalnHaln（nn）只有1条613 bp带（见图3和表3）。

图2 Haln基因PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR products of halothane gene

图3 民猪Haln基因PCR产物Hha I酶切电泳Fig.3 Electrophoersis pattern of Hha I-RFLP of halothane gene's PCR products in Min pig

表3 民猪群体的Haln基因座位的基因型频率和基因频率Table 3 Genotypic frequency and gene frequency in halothane gene of Min pigs

2.4 PCR产物序列分析

对HalNN型民猪、太湖猪、内江猪、成华猪、雅南猪、长白猪、二花脸、香猪、藏猪、长白猪和皮特兰猪的含C1843在内的614 bp Haln基因片段进行了序列分析与品种（系）间的比较，民猪Haln基因序列如下（见图4和表4）。

图4 民猪Haln基因PCR产物序列Fig.4 Sequence of PCR products of halothane gene in Min pig

表4 11个品种猪Haln基因部分片段DNA序列变异位点Table 4 Mutation sites in Halngene amino acid sequence of 11 varieties pigs

3 讨论

自Fujii等确定了猪Haln基因的核苷酸序列和突变位点以来[1]，PCR-RFLP技术检测Haln基因型变得日趋完善[17]，有的国家已建立了猪Haln基因的DNA检测方法[18-20]，并在大范围内对猪育种群体进行了Haln座位的基因型分析[18]，对有效控制猪群的Haln基因频率起到了重要的作用[20]。虽然我国Haln基因DNA检测技术和分子生物学分析刚刚起步，但随着国外优良品种的引入和我国猪遗传改良的进一步深入，以及瘦肉品种、品系的培育，Haln基因的研究将引起重视，并将得到应用和发展。

3.1 不同品种猪Haln基因座位的基因频率

本研究中民猪的Haln基因频率与国内报道有一定的差异，比方美英（10%）[8]、李来记（15.62%）[10]报道的Haln基因频率稍大，这可能是由于随机抽样，隐性Haln基因的样本过于集中，使试验数据较高；或者是由于该样本处于保种群体中，长期的近交使得Haln基因频率增加。Fujii等证明了长白、杜洛克、皮特兰等品种的Haln基因具有同一起源[1]，而关于民猪Haln基因的起源还未被证实，有待进一步研究。

3.2 不同品种Haln基因序列的种间差异

Fujii等通过对皮特兰猪和约克夏猪的HalncDNA全序列比较[1]，发现18个单碱基的差异。本文通过对不同品种（系）Haln基因序列比较分析，发现不同品种（系）间Haln612序列存在差异：皮特兰猪C1843→T1843；皮特兰A1437→G1437；二花脸和皮特兰C1544→T1544；皮特兰 T1555→C1555；皮特兰 C1582→T1582；长白-Brenig、藏猪和长白C1585→T1585，太湖猪、内江猪、成华猪长白-Brenig和二花脸A1588→G1588；成华猪 T1626→C1626；皮特兰 C1674→G1674；皮特兰 C1751→T1751；皮特兰 C1800→T1800；皮特兰 C1844→T1844；内江猪C1888→T1888；二花脸和皮特兰G1981→A1981。在所比较的11个猪品种（系）间Haln基因的DNA序列差异均为单核苷酸的替换，未发现多碱基和大片段的插入、缺失和移框突变。除Fujii等确定的C1843→T1843的突变造成氨基酸替代（Arg615→Cys615）与猪PSS有关外，其他的引起氨基酸改变的碱基突变与猪PSS的关系还有待证实[1]。而本研究中所发现的品种间13个突变大部分可能属于品种特异性改变，与猪PSS的发生是否有关还有待进一步分析。

4 结论

本试验通过PCR-RFLP方法检测了民猪群体中Haln基因的基因型频率和基因频率，结果表明民猪在长期的保种过程中HalnHaln型基因频率有所增加，n基因频率稍有升高。在比较民猪与其他品种猪Haln基因序列的区别时，发现皮特兰与民猪的差异最大，内江猪与民猪的差别最小。这个结果可以很有效的说明皮特兰猪肉质较差，而民猪肉质较好的原因。在实际生产中Haln基因给猪肉生产者和猪肉加工者带来了巨大的损失，因此，通过遗传育种选育抗应激的猪种具有实际意义。

[1] Fujii J,Otsu K and Zorzato F,et al.Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia[J].Scinece,1991,253:448-451.

[2] Brening B,Brem G.Molecular clocuing and analyais of the potcine"haloinabane"gene[J].Areh Tiera Dummeratcaf,1992,3215:129-135.

[3] 赵秀娟,帅素容.氟烷基因研究进展概述[J].畜禽业,2002(7):10-12.

[4] 蒋思远,熊远著,邓昌彦,等.猪氟烷基因与成产性状关系的初步研究[J].中国畜牧杂志,1995(5):20-21.

[5] 蒋思远,熊远著,邓昌彦,等.猪RYR1基因的PCR-RFLP分析和氟烷基因利用的研究[J].中国畜牧杂志,1997,33(2):9-10.

[6] 李来记.猪MHS基因分子遗传学基础与应用研究[D].北京:中国农业大学,1996.

[7] 陈蕴颖,步宏,李幼平,等.中国内江猪的氟烷基因型[J].华西医科大学学报,1999,30(2):117.

[8] 方美英,姜志华,刘红林,等.不同猪种中氟烷基因频率调查分析[J].浙江农业大学学报,1999,11(3):145-147.

[9] 赵中权,帅素容,杨显彬,等.藏猪氟烷基因PCR-RFLP和序列多态性分析[J].农业生物技术学报,2008,16(1):51-54.

[10] 李来记,张沅,李宁.猪恶性高热综合征(MHS)基因群体检测及部分片段DNA序列研究[J].中国畜牧兽医学报,1996,16(6):540-545.

[11] 帅素容,李学伟,赵秀娟,等.中国6个地方猪种与3个外种猪氟烷基因PCR产物序列比较研究[J].中国畜牧杂志,2005,41(2):12-15.

[12] 中国猪品种志.中国猪品种志[M].上海:上海科学技术出版社,1986.

[13] 郑兆利,王亚波,高健,等.民猪的杂交利用及产品开发的研究[J].中国猪业,2006,24(5):90-91.

[14] 农业部.国家级畜禽品种资源保护名录[S].北京中国畜牧兽医信息网,2001.

[15] Brenig B,Brem G.Genomic organization and analysis of 5’end of the porcine ryanodine receptor gene(yry1)[J].FEBS Letter,1992,298(2-3):277-279.

[16] Nakajima E,Matsumoto T,Yamada T,et al.Technicai note:use of a PCR-RFLP for detection of a point mutation in the swine ryanodine receptor(RYR1)gene[J].J Anim Sci,1996,74:2904-2906.

[17] Qtsu k,Philips M,Khanna V.Refinement of diagnostic assays for a probable causal mutation for porcine and human malignant hyperrhermin[J].Genomics,1992,13:835-836.

[18] Hughes I,Moran C,Nicholas F.PCR genotypiag of the rynnodine receptorgene forputative causalmutatton formalignant hyperthermta in Australian pig[J].J Anim Breed Genet,1992,109:466-476.

[19] Zhang X,Shen H,Cory C,et al.Demonstratron of the mutation associated wtth porcme stress syndrome[M].Ohnishi S T,Ohnishi T A genete membrane drsease.Boca Raton:CRC Press,1994:273-292.

[20] Dicksou D.DNA testmg helps British brtng better pig to market[J].Nature,1993,22(3):662-688.