大蒜素对白色念珠菌感染的免疫抑制小鼠IL-4和IgG产生水平的影响

胡国伟，董 群

(皖南医学院 微生物学与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002)

白色念珠菌是医院真菌感染最常见的致病菌，可引起人类皮肤黏膜、内脏各系统感染。近年来，由于免疫抑制剂的大量应用，肿瘤放疗、化疗、侵入性治疗、器官移植的开展，以及滥用广谱抗生素导致的菌群失调，白色念珠菌的感染率较以往有明显增加［1］。目前，治疗深部真菌感染药物为化学性药物，但在长期治疗和重复给药过程中容易引起耐药菌株的出现，而且具有不同程度的副作用。实验证明大蒜素具有广谱抗微生物的活性，包括抗细菌活性、抗真菌活性，尤其抗白色念珠菌具有抗寄生虫和抗病毒的活性［2，3］。我们通过观察大蒜素对白色念珠菌感染模型鼠脾细胞IL-4、血清IgG产生水平的影响，进一步探讨其预防和治疗白色念珠菌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康BALB/C雄性小鼠30只，6～8周龄，体量20～22 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物合格证号:SCXK(苏)2008.0010。

1.1.2 供试菌株 本实验使用的白色念珠菌(Candida.Albicans，C.albicans)标准菌株购自广州市微生物研究所。

1.1.3 药物及试剂 大蒜素胶囊购自江苏正大清江制药有限公司;环磷酰胺购自山西普德药业有限公司;小鼠IgG检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;小鼠IL-4试剂盒购自南京欣博盛生物科技发展有限公司;Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒购自大连宝生物科技发展有限公司;引物1，2［4］:根据真菌内转录间隔区(ITS)设计通用引物一对，由大连宝生物技术有限责任公司合成，ITS1:5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，ITS4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。

1.1.4 仪器 二氧化碳(CO2)恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂，型号:TC 2323型);酶标仪(郑州博塞生物工程有限责任公司，型号:2000型);高速冷冻离心机(上海良平仪器仪表有限公司);PCR仪(英国Techne公司)，Gel Doc1000凝胶成像系统(Bio Rad公司)，电泳仪(Bio Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌培养及菌液的制备 将白色念珠菌标准菌株接种到改良沙氏(Sabourand's)固体培养基上(1 L蒸馏水中加入葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂18 g，高压灭菌112℃ 15 min，待培养基冷却至50℃左右时加入青霉素20 U/ml，链霉素40 U/ml)，37℃细胞培养箱中培养48 h后，经无菌生理盐水洗下制成菌悬液，血球计数板调整菌液浓度为2×107/ml，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 小鼠免疫力低下模型的建立［5］30只小鼠实验前3 d腹腔一次性注射环磷酰胺200 mg/kg，每只0.2 ml，制备免疫力低下小鼠模型。

1.2.3 实验分组及处理 将30只免疫力低下小鼠随机分为3组，每组10只。预防组小鼠每天灌服1次 25 mg/(kg·d)大蒜素 0.4 ml×7 d，其余两组灌服等量生理盐水7 d;第8天各组小鼠尾静脉接种2×107/ml白色念珠菌菌液0.2 ml，同时给予预防组和治疗组分别灌服25 mg/(kg·d)大蒜素0.4 ml×7 d，感染组灌服等量生理盐水7 d。

1.2.4 小鼠脾细胞悬液的制备 无菌取出各组脾脏。将脾脏置入无菌平皿中的不锈钢筛网(100目/cm2)上，加入5 ml Hanks液，用玻璃注射器针芯充分研磨，经网制成单细胞悬液，1 000 rpm离心10 min，弃上清，加Tris-NH4Cl 2 ml吹打去除红细胞，不完全RPMI-1640液洗2次，再用完全RPMI-1640液充分重悬细胞，即为脾细胞悬液。

1.2.5 用双抗体夹心ELISA法测定小鼠脾细胞悬液IL-4水平以及血清IgG的水平 具体操作严格按试剂盒说明书程序进行。

1.2.6 白色念珠菌DNA的抽提 各组小鼠于尾静脉注入白色念珠菌液次日分别摘眼球取血，严格按照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。

1.2.7 白色念珠菌引物扩增的实验 用设计的白色念珠菌引物对各样本进行PCR扩增并均采用50 μl反应体系，反应体系为:10×反应缓冲液5 μl;DNA 模板 2 μl;Taq 酶(5 U/μl)0.2 μl;dNTP mixture(2.5 mmol/L)4 μl;引物各 2 μl;其余为双蒸水。PCR条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸7 min，35个循环;反应结束后，产物于4℃保存，等待电泳。

1.2.8 PCR扩增产物检测 取各扩增产物8 μl与2 μl上样缓冲液(4∶1)混匀后，依次点样于1%琼脂糖凝胶上(含 EB 0.5 μg/ml)，在1×TAE 电泳缓冲液中进行电泳，以DL-2000为分子量标准，5 V/cm电压电泳。当溴酚兰至适当位置后，切断电源，在紫外线和BIO-RAD凝胶成像分析系统上进行分析和拍照。

2 结果

2.1 免疫抑制模型小鼠的建立 小鼠经注射环磷酰胺后均无自然死亡现象，次日各组小鼠出现喜静、少动、饮食明显减少、多尿、皮毛欠光滑等现象，与临床上免疫力低下患者纳差、消瘦、懒动乏力等症状相似。

2.2 白色念珠菌感染模型鼠的建立 无菌条件下，取出各组小鼠的血液标本。按照前述的方法，分离、抽提白色念珠菌DNA和PCR扩增，于1%琼脂糖凝胶上检测。结果显示除阴性对照未见条带外，其余各样本均可扩增出分子量大小约为500 bp特异性条带。见图1～3。

图1 预防组小鼠PCR扩增产物电泳图Fig 1 Eelectropherogram of PCR products in preventive group

图2 治疗组小鼠PCR扩增产物电泳图Fig 2 Eelectropherogram of PCR products in treatment group

图3 感染组小鼠PCR扩增产物电泳图Fig 3 Eelectropherogram of PCR products in infective group

2.3 小鼠脾细胞悬液IL-4水平 由表1可见，预防组与感染组比较，IL-4水平增高显著，两组之间差异显著(P＜0.01)。治疗组与感染组比较，IL-4水平增高显著，两组之间差异显著有统计学意义(P＜0.01)。预防组和治疗组之间IL-4水平比较，也有明显的统计学意义(P＜0.01)。

表1 各组小鼠脾细胞悬液IL-4水平(±s)Tab 1 IL-4 level of cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

表1 各组小鼠脾细胞悬液IL-4水平(±s)Tab 1 IL-4 level of cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

两两比较采用q检验，两组间字母不同表示P＜0.05;两组间字母相同表示P﹥0.05

组别 n IL-4表达水平(pg/ml) F值 P值预防组 10 26.51 ±1.45a治疗组 10 17.29±1.23b 405.70 ＜0.01感染组 10 10.45 ±1.09c

2.4 小鼠血清IgG水平 由表2可见，预防组与感染组比较，IgG水平增高显著，两组之间差异有显著统计学意义(P＜0.01)。治疗组与感染组比较，IgG水平增高显著，两组之间差异有显著统计学意义(P＜0.01)。预防组和治疗组之间IgG水平比较，也有明显统计学意义(P＜0.01)。

表2 各组小鼠血清IgG水平(±s)Tab 2 Serum level of IgG for each group(±s)

表2 各组小鼠血清IgG水平(±s)Tab 2 Serum level of IgG for each group(±s)

两两比较采用q检验，两组间字母不同表示P＜0.05;两组间字母相同表示P＞0.05

组别 n IgG表达水平(pg/ml) F值 P值预防组 10 0.2106 ±0.0248a治疗组 10 0.1589±0.0158b 54.05 ＜0.01感染组 10 0.1169 ±0.0145c

3 讨论

白色念珠菌是寄居在正常人体消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜的正常菌群，一般不致病，仅在长期的粒细胞减少、血液系统恶性肿瘤、长期应用糖皮质激素、骨髓移植或实体器官移植及AIDS等情况下致机体免疫力减弱时，大量白色念珠菌的入侵可能发病。有资料表明应用生物反应调节剂(Biological Response Modifer，BRM)防治深部真菌感染是可行的方法。传统BRM如BCG、IL2、转移因子等均存在着程度不同的毒副作用及价格较昂贵等缺点，使之在临床应用上受到一定的限制。而大蒜是百合科葱属植物蒜地下鳞茎，主要功效成分是蒜氨酸，具有广谱抗菌消炎作用，我室前期的研究［6～9］已证实其具有提高机体细胞免疫功能等作用，但对体液免疫功能有无影响尚不知。

IgG是体液免疫应答产生的一种最主要保护性抗体，血清中含量最高，半衰期长，在机体防御机制中发挥抗感染、中和毒素及调理作用，且有保护黏膜的作用［10］。IL-4由T细胞产生能促进B细胞的增殖、分化和抗体的生成，可增强B细胞介导的体液免疫应答，因此，IL-4又称B细胞生长因子(B cell growth factor，BGCF)。本实验将大蒜素经口灌服小鼠，观察体液中IgG、IL-4含量的变化。结果发现，大蒜素能提高治疗组和预防组小鼠IgG和IL-4水平，尤以预防组的效果最明显，提示大蒜素亦可增强体液免疫功能。

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