大蒜素对烟曲霉菌感染小鼠的细胞免疫功能的影响

潘中武，董 群

(皖南医学院 微生物学与免疫学教研室，安徽 芜湖 241002)

曲霉菌在自然界中分布十分广泛，有多种曲霉菌能引起人类和动物感染，其中最常见的是烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus，Af)。烟曲霉菌为腐生菌，其孢子直径小，能在空气中传播，人吸入后可在气道内定植、感染［1］。正常人吸入孢子后并不致病，但对免疫功能低下的人群，可引起侵袭性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillus，IPA)。近年来，糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素的广泛应用，以及肿瘤的放化疗、器官移植、血液透析、艾滋病的流行等都成为侵袭性曲霉菌感染的危险因素，临床有效的抗真菌药物不多，且毒副作用强。IPA预后不佳，患者的病死率在 56% ～88.1%之间［2，3］。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种健康小鼠30只，雌雄各半，5～6周龄，体重(20±2)g左右，购自南京青龙山动物繁殖中心，置于相对清洁、恒温环境中，分笼饲养，自由取水。

1.2 供试菌株 烟曲霉菌(CCCCMIDA1)，购于中国医学真菌中心。

1.3 药物 大蒜素胶囊，购自江苏正大清江制药有限公司。

1.4 主要试剂 IL-12、IFN-γ 检测试剂盒，购自上海森雄科技实验有限公司。

1.5 实验分组 将30只昆明种小鼠随机分为对照组、预防组、治疗组，每组10只。实验前3组小鼠均给予腹腔内一次性注射环磷酰胺(CY)200 mg/kg(CY用NS配制成20 mg/ml注射液，根据小鼠体重注射不同容量)。实验时，预防组每天灌服1次25 mg/(kg·d)大蒜素溶液 0.5 ml/次 ×14 d;治疗组第1～7天灌服等量生理盐水，第8～14天灌服同剂量大蒜素，对照组灌服等量生理盐水14 d。实验第8天给各组小鼠于麻醉后鼻腔滴入烟曲霉菌孢子悬液 50 μl，孢子浓度为 1.0 ×107/ml。

1.6 实验指标及测定方法 用75%酒精浸泡消毒小鼠，无菌取出脾脏，常规制备脾细胞，用 RPMI 1640完全培养液配成5×106/ml脾细胞悬液;采用MTT法检测T细胞活性;采用ELISA法检测脾细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ的表达水平。

1.7 统计学处理 运用SPSS11.5统计软件建立数据库，数值变量资料以±s表示，多组均数间比较采用单因素方差分析(F检验)，多组均数间两两比较采用SNK法(q检验)。

2 结果

2.1 大蒜素对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性的影响 预防组大蒜素灌胃7 d后再感染烟曲霉菌，脾脏T淋巴细胞增殖活性与对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)。治疗组在感染烟曲霉菌后给予大蒜素治疗7 d，脾脏T淋巴细胞增殖活性与对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)，预防组和治疗组比较，两组之间也有差异(P＜0.05)。提示大蒜素能提高小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性。

表1 各组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性(±s)Tab 1 Activity of spleen T-lymphocyte proliferation in each group(±s)

表1 各组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性(±s)Tab 1 Activity of spleen T-lymphocyte proliferation in each group(±s)

*表示治疗组和预防组与对照组之间两两比较，P＜0.05，△表示治疗组与预防组之间比较，P＜0.05

组别 n 增殖活性 F值 P值10 0.411 ±0.054预防组 10 1.015±0.065* 308.52 ＜0.01治疗组 10 0.697 ±0.041对照组＊△

2.2 脾细胞培养上清液中IFN-γ表达水平 由表2可见，预防组与对照组比较，IFN-γ水平显著增高，两组之间差异显著(P＜0.01)。治疗组IFN-γ水平与对照组比较，有显著统计学意义(P＜0.01)。预防组和治疗组之间IFN-γ水平比较，有统计学意义(P ＜0.05)。

表2 各组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ表达水平(±s)Tab 2 Level of IFN-γ expression in cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

表2 各组小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ表达水平(±s)Tab 2 Level of IFN-γ expression in cultural liquid of spleen cells for each group(±s)

*表示治疗组和预防组与对照组之间两两比较，P＜0.05，△表示治疗组与预防组之间比较，P＜0.05

组别 n IFN-γ 表达水平(pg/ml) F值 P值10 87.672 ±5.768预防组 10 190.839±6.958* 733.805 ＜0.01治疗组 10 131.562 ±5.283对照组＊△

2.3 脾细胞培养上清液中IL-12表达水平 由表3可见，预防组与对照组比较，IL-12水平增高显著，两组之间差异显著(P＜0.01)。治疗组IL-12水平与对照组比较，有显著统计学意义(P＜0.01)。预防组和治疗组之间IL-12水平比较，有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组小鼠脾细胞培养上清液中IL-12表达水平(±s)Tab 3 Level of IL-12 expression in supernatant solution of spleen cells for each group(±s)

表3 各组小鼠脾细胞培养上清液中IL-12表达水平(±s)Tab 3 Level of IL-12 expression in supernatant solution of spleen cells for each group(±s)

*表示治疗组和预防组与对照组之间两两比较，P＜0.05，△表示治疗组与预防组之间比较，P＜0.05

组别 n IL-12表达水平(pg/ml) F值 P值10 29.084 ±2.095预防组 10 69.103±3.743* 445.879 ＜0.01治疗组 10 50.726 ±2.932对照组＊△

3 讨论

曲霉菌为条件致病菌，在自然界分布广泛，能引起人类疾病最常见的多为烟曲霉菌。烟曲霉菌常寄生在上呼吸道，其孢子进入下呼吸道后定植，在条件适宜时，则出芽形成菌丝，造成组织破坏，形成IPA。近十年来，随着免疫抑制患者的不断增多，呼吸道真菌感染的发病率逐渐增高，IPA逐渐成为临床上危害大、病死率高的呼吸道真菌感染，其发病率甚至已经超过了最常见的真菌感染——侵袭性念珠菌病，成为威胁免疫受损宿主生命的严重感染性疾病之一。在秋冬和阴雨季节，大量吸入烟曲霉菌孢子可引起本病的急性发作。

IPA早期诊断极为困难，治疗成功率很低，患者病死率高。烟曲霉菌在免疫健全宿主及少量菌存在时一般不致病，仅在长期的粒细胞减少、血液系统恶性肿瘤、长期应用糖皮质激素、骨髓移植或实体器官移植及AIDS等致机体免疫力减弱时，大量烟曲霉菌的入侵才可能发病，造成组织缺血、坏死;菌丝还可穿透支气管或细支气管壁，形成急性坏死化脓性肺炎，甚至形成空洞。

烟曲霉菌侵入后机体可启动固有性及获得性免疫应答。抗烟曲霉免疫以细胞免疫为主，在烟曲霉菌感染过程中，肺泡巨噬细胞和中性粒细胞可吞噬和杀伤吸入的孢子，抑制孢子生成菌丝，是抗烟曲霉菌感染的第一道防线，构成抗烟曲霉菌的天然免疫。相关研究表明，在正常机体内，当烟曲霉菌侵入下呼吸道时，巨噬细胞和中性粒细胞迅速聚集于感染部位，释放多种炎症因子，体内产生Th1型细胞反应，IL-12、IFN-γ等增多，增强效应细胞的抗菌能力，有利于机体清除烟曲霉菌［4，5］。IL-12、IFN-γ 不仅能增强吞噬细胞的杀伤活性，而且能够促进初始T细胞向Th1细胞方向进行分化，活化NK细胞，降低宿主体内铁负荷等［6］。

本实验将大蒜素用于IPA的防治，结果发现，大蒜素能提高治疗组和预防组小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖活性和IL-12、IFN-γ水平，增强机体抗烟曲霉菌的能力［7，8］，尤其是预防组。本研究提示坚持服用一定量的大蒜素可以为临床防治IPA提供积极的帮助。

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