亚急性酒精中毒大鼠的学习记忆与海马p-CREB表达的相关性研究

李兴伟，吴鉴明

(皖南医学院 医学三系，安徽 芜湖 241002)

酒精中毒是一种遍及全球的公共卫生问题。酒精中毒可以因酒精毒性作用、代谢异常等因素而导致多系统的急、慢性病变。酒精中毒能够导致机体发生多种病理性改变，其中以脑损害最为突出，导致认知功能的异常。已知环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)通过CREB 133位磷酸化(p-CREB)，通过对各种神经活性蛋白的翻译，最终影响学习记忆功能［1］。目前关于p-CREB与酒精染毒对学习记忆功能损伤的研究少见报道［2］。本研究通过测定不同浓度酒精对大鼠学习记忆功能的影响，以期阐明酒精摄入时间、剂量与神经行为改变之间的关系以及行为学与病理变化的关系，探讨亚急性酒精染毒大鼠的学习记忆与p-CREB表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 雄性SD清洁型大鼠(购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场，合格证号:2015668)60只，约7周龄，体重180～220 g。随机平均分为4组:对照组(control group，C组)，低浓度染毒组(low alcohol administration group，L 组)，中浓度染毒组(moderate alcohol administration group，M 组)，高浓度染毒组(high alcohol administration group，H组)。

1.2 方法 大鼠正常喂养1周后开始染毒。无水乙醇分别配制成酒精含量为0.16 g/ml(低浓度组)、0.32 g/ml(中浓度组)、0.48 g/ml(高浓度组)的溶液，按15 ml/kg体重进行灌胃，对照组用15 ml/kg体重蒸馏水灌胃。第1周每天分两次灌胃，每两天间隔1 d，第2周改为每天灌胃1次，每3天间隔1 d。各组分别在灌胃14 d、21 d和28 d后行以下实验。

1.2.1 行为学实验

1.2.1.1 一般观察 每周观察记录大鼠饮食、体重、睡眠和活动等。

1.2.1.2 Morris水迷宫实验 实验前训练:酒精溶液灌胃前，在水迷宫中大鼠游泳训练，随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，3次分别从3个象限(目标象限除外)的入水点入水，直至大鼠入水后能够找到平台。历时3 d，第1天让大鼠自由游泳2 min。从第2天起，每天训练3次，每次间隔1 h。

潜伏期(定位航行实验，反映空间记忆的获得和参照物记忆能力):即大鼠由入水到爬上隐匿平台的时间(s)。如果大鼠在120 s内未找到平台，将其引至平台上放置20s，这时潜伏期记为120 s。

寻求正确次数(空间搜索实验，检测空间记忆的保持和工作记忆能力):撤去平台，即大鼠2 min内经过原平台位置上方水域(探索策略)的次数，得出目标象限时间/总时间。

1.2.2 血液酒精浓度检测 不同天数的染毒大鼠，水迷宫试验结束后戊巴比妥腹腔麻醉，心腔取血，用气相色谱仪(HP6890)检测大鼠血液酒精浓度。

1.2.3 海马组织的病理学观察 取血后的大鼠经心脏快速灌注冲洗生理盐水约250 ml，再用4%多聚甲醛(PBS配制，pH 7.4)约500 ml灌注冲洗固定，取全脑，在4%多聚甲醛中固定20 h，脱水、包埋、切片，HE染色，光镜观察组织细胞形态。

1.2.4 p-CREB蛋白免疫组化染色 同以上(1.2.3)方法制作的切片，按照p-CREB蛋白免疫组织化学染色试剂盒说明，进行免疫组化染色操作(SABC法)。

1.2.5 图像分析 用Olympus显微镜和计算机影像分析系统进行图像分析。高倍(×400)视野下，利用0.2网形目镜尺分别对大鼠海马CA3区随机选取5个视野，依次计数每个视野内阳性细胞数，以其平均值作为该切片层面的阳性细胞数，以同一个动物4个切片层面的平均阳性细胞数作为该动物的阳性细胞数，各组动物再分别计算其组内阳性细胞数。

1.2.6 统计学处理 实验数据利用方差分析，组间两两比较用SNK检验，对样本的血液酒精浓度、海马p-CREB阳性细胞数、行为学反应三项结果，进行相关分析。检验水准:α =0.05，P ＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 一般观察 染毒1周后，对照组及低浓度组大鼠灌胃操作顺利，中浓度组和高浓度组灌胃有抗拒。对照组大鼠体重正常增长;低浓度多数大鼠出现体重过度增长;中、高浓度组多数大鼠出现精神萎靡，觅食及活动减少，营养不良，毛发无光泽，体重增长缓慢或下降。

2.2 行为学检测结果 见表1～4。

表1 酒精染毒前大鼠的学习记忆情况(±s，n=15)Tab 1 The conditions of learning and memory in rats before alcohol exposure(±s，n=15)

表1 酒精染毒前大鼠的学习记忆情况(±s，n=15)Tab 1 The conditions of learning and memory in rats before alcohol exposure(±s，n=15)

C、L、M、H分别代表对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组。右上角字母相同者表示SNK法比较P＞0.05，字母不同者表示P＜0.05，下同

项目 C L M H F值 P值潜伏期(s) 34.3 ±12.7a 42.6 ±18.5a 39.8 ±10.4a 36.4 ±14.2a 0.906 0.447 1.626 0.198寻求正确次数 5.13 ±1.96a 5.08 ±1.68a 5.58 ±1.62a 5.08 ±2.35a 0.190 0.903目标象限时间/总时间 0.34 ±0.09a 0.35 ±0.11a 0.30 ±0.06a 0.31 ±0.09a

表2 酒精染毒14 d对大鼠学习记忆的影响(±s，n=15)Tab 2 Alcohol exposure for 14 days on learning and memory in rats(±s，n=15)

表2 酒精染毒14 d对大鼠学习记忆的影响(±s，n=15)Tab 2 Alcohol exposure for 14 days on learning and memory in rats(±s，n=15)

项目 C L M H F值 P值潜伏期(s) 28.0 ±11.1a 33.0 ±15.5a 45.3 ±19.3a 52.6 ±25.3b 3.597 0.022寻求正确次数 4.75 ±1.67a 3.67 ±1.61a 3.92 ±1.93a 4.08 ±1.51a 0.691 0.563目标象限时间/总时间 0.40 ±0.07a 0.40 ±0.08a 0.44 ±0.18a 0.44 ±0.18a 0.266 0.850

表3 酒精染毒21 d对大鼠学习记忆的影响(±s，n=10)Tab 3 Alcohol exposure for 21 days on learning and memory in rats(±s，n=10)

表3 酒精染毒21 d对大鼠学习记忆的影响(±s，n=10)Tab 3 Alcohol exposure for 21 days on learning and memory in rats(±s，n=10)

项目 C L M H F值 P值潜伏期(s) 26.8 ±11.1a 41.4 ±18.7a 54.3 ±21.4b 60.1 ±28.4b 4.043 0.017寻求正确次数 5.75 ±1.76a 3.50 ±1.51b 3.13 ±0.99b 2.63 ±1.06b 3.856 0.020目标象限时间/总时间 0.33 ±0.14a 0.18 ±0.08b 0.20 ±0.07b 0.25 ±0.09b 8.172 0.000

表4 酒精染毒28 d对大鼠学习记忆的影响(±s，n=5)Tab 4 Alcohol exposure for 28 days on learning and memory in rats(±s，n=5)

表4 酒精染毒28 d对大鼠学习记忆的影响(±s，n=5)Tab 4 Alcohol exposure for 28 days on learning and memory in rats(±s，n=5)

项目 C L M H F值 P值潜伏期(s) 13.3 ±4.03a 50.0 ±10.4b 72.5 ±32.0b 79.0 ±28.0b 7.303 0.005寻求正确次数 6.25 ±1.26a 2.00 ±0.82b 1.50 ±0.58b 1.25 ±0.96b 25.333 0.000目标象限时间/总时间 0.38 ±0.03a 0.25 ±0.07b 0.23 ±0.01b 0.18 ±0.07b 11.071 0.001

表1表明，大鼠染毒前学习记忆差异无统计学意义(P＞0.05)。由表2～4可见，酒精染毒14 d，高浓度组大鼠潜伏期增加，与对照组相比差异显著(P ＜0.05);酒精染毒21 d、28 d 时，低、中、高浓度3组大鼠潜伏期增加，中、高浓度组2 min内寻求正确次数减少、目标时间/总时间下降低，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。

2.3 血液酒精浓度检测结果 各组大鼠不同染毒天数的血液酒精浓度见表5。

表5 4组大鼠不同染毒天数的血液酒精浓度＊＊(mg/100 ml，±s，n=5*)Tab 5 Blood alcohol concentration in rats of the 4 groups at diverse days of exposure to alcohol(mg/100 ml，±s，n=5*)

表5 4组大鼠不同染毒天数的血液酒精浓度＊＊(mg/100 ml，±s，n=5*)Tab 5 Blood alcohol concentration in rats of the 4 groups at diverse days of exposure to alcohol(mg/100 ml，±s，n=5*)

* 每次按照序号取5只大鼠(n=5)采血，余下进入下阶段实验;＊＊最后一次灌胃1 h后取血，然后取脑检测其他指标

天数 C L M H F值 P值14 d 0.00a 37.05 ±4.72b 66.95 ±15.88c 125.89 ±18.70d 292.358 0.000 90.714 0.000 21 d 0.00a 22.74 ±8.12b 35.37 ±4.56c 48.50 ±4.90d 76.878 0.000 28 d 0.00a 59.03 ±4.16b 104.17 ±9.82c 173.56 ±15.92d

2.4 病理学实验结果

2.4.1 HE染色 高浓度14 d组及低、中、高浓度21 d、28 d组大鼠海马CA1、CA3区及齿状回神经细胞均出现不同程度的排列不规则，层数减少，部分细胞体积增大，海马细胞变性，数目减少，排列紊乱，尤其以高浓度28 d组较为明显(图1～4)。

2.4.2 海马 p-CREB免疫阳性细胞的表达 p-CREB免疫阳性细胞核呈圆形和椭圆形，大小不均，大多数显色较深，光镜下呈均质状，边界清晰。对照组齿状回颗粒层p-CREB免疫阳性细胞的体积小且密集，成典型的带状分布，CA3区的锥体细胞层的阳性细胞较颗粒层明显减少且体积较大。酒精染毒14 d时，对照组和低浓度组p-CREB表达明显，海马锥体细胞着色较深，中、高浓度组大鼠海马p-CREB表达较对照组明显下降(P＜0.05);酒精染毒21、28 d时，低、中、高浓度组大鼠海马p-CREB表达较对照组明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05，图5～8)。

表6 大鼠海马组织CA3区p-CREB阳性细胞数比较(±s，n=5*)Tab 6 Comparison of p-CREB positive cell number in CA3 zone of hippocampus(±s，n=5*)

表6 大鼠海马组织CA3区p-CREB阳性细胞数比较(±s，n=5*)Tab 6 Comparison of p-CREB positive cell number in CA3 zone of hippocampus(±s，n=5*)

* 每次按照序号取5只大鼠(n=5)采血后解剖取脑组织，余下进入下阶段实验

14 d 21 d 28 d C 125.20 ±19.98a 125.20 ±19.98a 125.20 ±19.98a 0.006 0.000 0.000 L 109.00 ±8.66a 101.20 ±9.36b 85.80 ±5.63b M 104.20 ±10.89b 92.60 ±11.72b 72.00 ±11.68b H 90.00 ±9.67b 78.00 ±9.67b 54.00 ±8.28c F 值 6.139 10.896 28.787 P值

2.5 血液酒精浓度与p-CREB及行为学反应的相关性 见表7、8。

表7 血液酒精浓度的p-CREB及行为学反应相关性分析Tab 7 Pearson correlation analysis of blood alcohol concentration and p-CREB and behavioral responses

表7表明:除酒精染毒14 d大鼠血液酒精浓度与寻求正确次数相关性无统计学意义外，其余各组指标与血液酒精浓度有相关性:随着酒精浓度的增加，潜伏期延长，寻求正确次数减少、阳性细胞数下降，且具有统计学意义(P＜0.05)。

表8表明:酒精染毒14 d和28 d，大鼠血液酒精浓度与寻求正确次数的线性回归关系无统计学意义(P＞0.05)，而与潜伏期、阳性细胞数线性回归关系有统计学意义(P＜0.05);酒精染毒21 d大鼠血液酒精浓度与潜伏期及寻求正确次数的线性回归关系无统计学意义(P＞0.05)，而与阳性细胞数的线性回归关系有统计学意义(P＜0.05)。

表8 血液酒精浓度与p-CREB及行为学反应的多因素线性回归分析Tab 8 Multiple linear regression analysis of blood alcohol concentration and p-CREB and behavioral responses

3 讨论

3.1 亚急性酒精中毒动物模型 已有研究者用体积分数为30%的乙醇溶液按10 ml/kg剂量给实验小鼠灌胃，发现亚急性酒精中毒致小鼠学习记忆功能障碍及海马突触界面结构可塑性退变［3］。本实验以 0.16 g/ml、0.32 g/ml、0.48 g/ml三种浓度酒精溶液，按15 ml/kg体重(生理盐水作为对照)，分别灌胃14 d、21 d、28 d后，检测实验大鼠的学习记忆行为学反应、p-CREB表达水平变化及海马CA1、CA3区及齿状回神经细胞的病理形态学改变。统计学分析显示，上述三者与血液酒精浓度之间存在剂量-反应的相关性。故认为初步建立了亚急性酒精中毒的动物模型。

3.2 酒精对实验动物行为学影响 Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)是用于研究大鼠空间学习记忆的装置，在研究动物的行为学实验中得到了广泛应用［4，5］。乙醇为低分子脂溶性物质，摄入乙醇1 h内血液中乙醇含量达到最高，之后呈直线趋势下降［6］，故在酒精溶液灌胃后1 h之内取血为宜。

本实验发现各染毒组酒精灌胃不同天数后，随着酒精剂量、时间的增加，大鼠记忆能力受到抑制，潜伏期延长，错误次数增加，该抑制作用增强。酒精染毒14 d，高浓度组大鼠潜伏期增加，与对照组相比差异显著(P ＜0.05);酒精染毒 21 d、28 d 时，低、中、高浓度3组大鼠潜伏期增加，中、高浓度组2 min内寻求正确次数减少、目标象限时间/总时间下降低，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。表明高浓度组的血液酒精浓度(125.89 mg/100 ml)在14 d内即已经造成大鼠记忆再现障碍，低浓度组(39.61 mg/100 ml)、中浓度组(68.83 mg/100 ml)、高浓度组(115.98 mg/100 ml)在21 d内可造成大鼠记忆再现障碍。文献报道乙醇对小鼠学习记忆功能有明显的抑制作用［7，8］，本实验印证，这种抑制作用与染毒时间和血液酒精浓度存在相关性，即潜伏期和血液酒精浓度呈正相关 (P＜0.05);寻求正确次数和血液酒精浓度呈负相关 (P＜0.05)。

3.3 亚急性酒精中毒与p-CREB表达 在大脑细胞中表达的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)，是一种具有转录因子功能的蛋白，参与长期记忆的形成和短期记忆向长期记忆转化［1］，CREB 133位磷酸化(p-CREB)，可以启动下游基因转录，通过各种神经活性蛋白的翻译，最终影响单个神经元和整个神经元回路的功能，与学习记忆功能密切相关。Asher等在分子水平研究发现，酒精导致CREB磷酸化水平升高［9］;赵燕等研究急性酒精摄入海马内 CREB磷酸化水平升高［2］;又有研究［10，11］表明，慢性酒精暴露致鼠脑内 CREB 磷酸化水平降低，结果不完全一致。本实验观察到，酒精染毒14 d时，中、高浓度组大鼠海马p-CREB表达较对照组明显下降(P＜0.05);酒精染毒21、28 d时，低、中、高浓度组大鼠海马p-CREB表达较对照组明显下降(P＜0.05)。显示亚急性酒精染毒大鼠海马内CREB磷酸化水平下降，且海马 CA3区p-CREB阳性细胞数和血液酒精浓度呈负相关(P＜0.01)。因此认为，大鼠海马内CREB表达，可以作为实验动物亚急性酒精中毒的一项检测指标。

3.4 亚急性酒精中毒的神经病理改变 本实验观察到高浓度染毒14 d及低、中、高浓度染毒21 d、28 d，大鼠海马CA1、CA3区椎体细胞及齿状回颗粒细胞均出现不同程度的排列不规则，层数减少;部分细胞体积增大，海马细胞变性，数目减少，排列紊乱，以高浓度28 d组为明显(图3)。上述结果，与文献报道［12］相吻合。可以认为，大鼠海马 CA1、CA3区椎体细胞及齿状回颗粒细胞的变化，是亚急性酒精中毒的病理形态学基础。

综上所述，本研究通过酒精灌胃方式给大鼠染毒，运用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能损伤情况，建立了亚急性酒精中毒致大鼠学习记忆障碍模型。发现亚急性酒精中毒对学习记忆损伤与染毒时间、浓度呈直线正相关，可能通过调节海马内p-CREB蛋白表达来影响大鼠学习记忆能力。但海马内p-CREB如何调节学习记忆过程尚不清楚，有待今后进一步研究和探讨。

(致谢:1、本实验中水迷宫部分在皖南医学院细胞电生理研究室完成，由衷感谢导师汪萌芽教授的指导和秦雯同学的帮助;2、由衷感谢皖南医学院法医毒理教研室张武老师在酒精气象色谱检测中的指导。)

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