响应面法优选苦豆子多糖活性炭脱色工艺Δ

单晓菊，邸明磊，张岩，马丽娜，陶遵威（.天津中医药大学，天津市30093；2.天津市医药科学研究所，天津市 300020）

苦豆子（Sophora alopecuroides L.）系豆科槐属多年生草本植物[1]，主要分布在我国西北部干旱荒漠区。苦豆子全株味苦，性寒，药用根、茎、全草和种子，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用[2]。长期以来对苦豆子的研究多围绕其生物碱成分，对苦豆子多糖的研究较少，而近年来植物多糖的生物活性越来越受到重视。为了开发苦豆子多糖，课题组对苦豆子多糖进行了初步研究，发现其具有明显的抗肿瘤作用。苦豆子水提醇沉后得到的多糖为橙红色，影响产品外观、质量标准和安全。因此，苦豆子多糖脱色工艺显得尤为重要。活性炭是一种良好的吸附剂，具有吸附量大、再生速度快、污染小、对液体的流通阻力小等优点。有研究表明[3]，活性炭的脱色效果显著，但对多糖的吸附能力不高。因此，课题组选用活性炭为吸附剂，应用响应面优化法，进行苦豆子多糖脱色工艺的研究，以期找到适合工业化生产的苦豆子多糖最佳脱色工艺。

1 仪器与试药

JJ500电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；UV-260紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）；LXJ-ⅡB低速大容量多管离心机（北京医用离心机厂）；HH-4智能数显恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；真空冷冻干燥机（美国Labconco公司）。

苦豆子（豆科槐属，购于内蒙古磴口县金豆商贸有限公司，经天津市医药科学研究所天然药化室吴寿金研究员鉴定为真品）。活性炭（天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20090328）；无水乙醇、95%乙醇、浓硫酸、苯酚等试剂和葡萄糖均为分析纯，购自天津市化学试剂批发公司。

2 方法

2.1 苦豆子多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[4]。精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖20mg，置500m L量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配成0.04mg·m L-1的标准溶液。精确移取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8m L，置具塞试管中，各加水补充至2.0 m L，然后加入质量分数为6%的重蒸苯酚1.0m L、浓硫酸6.0 m L，摇匀，室温放置10m in，于490 nm波长处测定吸光度。以2.0m L水按同样显色操作作为空白，以吸光度（x）对葡萄糖质量浓度（y）作回归处理，得回归方程为y＝1.030 x－0.008（r＝0.999 5）。按下式计算多糖损失率：多糖损失率＝（脱色前多糖含量－脱色后多糖含量）/脱色前多糖含量×100%。

2.2 苦豆子多糖的提取

取苦豆子干品200 g，以85%乙醇回流脱脂3次，药渣置于通风处晾干，加20倍量水，在100℃沸水中提取3 h，趁热用布氏漏斗抽滤，减压浓缩，加4倍体积95%乙醇醇沉，置冰箱过夜，3 000 r·m in-1离心20m in，沉淀用适量无水乙醇洗涤2遍，真空冷冻干燥48 h，得苦豆子粗多糖，sevage法[5]脱蛋白后得苦豆子多糖，备用。

2.3 脱色率的计算

准确称取除蛋白后的苦豆子多糖5 g，加水溶解并定容至500m L，得苦豆子多糖溶液。在可见-紫外光谱700～200 nm波长范围内扫描，结果溶液无最大吸收波长。根据多糖溶液脱色前后均为橙黄色，故从溶液的互补色考虑选择测定波长为450 nm[3]，并按下式计算脱色率：脱色率＝（脱色前吸光度－脱色后吸光度）/脱色前吸光度×100%。

2.4 单因素试验

取“2.2”项下的苦豆子多糖溶液若干份，各20m L，依次以活性炭添加量、脱色时间、脱色温度为变量，测定苦豆子多糖损失率和脱色率，用以研究以上各变量对苦豆子多糖脱色效果的影响。

2.5 响应面优化试验

在单因素试验基础上，采用中心组合试验Box-Behnken设计方案，以活性炭添加量（W/V，A）、脱色时间（B）、脱色温度（C）为考察因素，并以+1、0、-1分别代表变量的水平，用响应面法优化工艺。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab 1 Factorsand levels

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 活性炭添加量对脱色效果的影响 分别选取活性炭添加量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，于40℃脱色1 h，离心，取上清液，测定脱色率和多糖损失率，结果分别见图1、图2。

由图1、图2可知，苦豆子多糖脱色率随着活性炭添加量的增加呈现先增加后降低的趋势，添加量＞3%后脱色率明显下降，原因可能是活性炭添加量过大不利于完全脱炭，反而影响多糖的脱色率；多糖损失率随活性炭添加量的增加而增加，主要原因是活性炭对多糖有少量的吸附作用。综上所述，活性炭的添加量应选择3%以下。

3.1.2 脱色时间对脱色效果的影响 取活性炭添加量为1%，在40 ℃水浴下分别脱色20、30、40、50、60、70、80、90、100m in，离心，取上清液，测定脱色率和多糖损失率，结果分别见图3、图4。

由图3、图4可知，苦豆子多糖脱色率在60min达到最大，以后随时间增加缓慢降低；多糖损失率随时间增加而增加，60 m in以后增长迅速。综合考虑，脱色时间选择应＜60m in。

3.1.3 脱色温度对脱色效果的影响 取活性炭添加量为1%，分别于20、30、40、50、60 ℃脱色1 h，离心，取上清液，测定脱色率和多糖损失率，结果分别见图5、图6。

由图5、图6可知，苦豆子多糖脱色率在50℃达到最大值，而多糖损失率在30℃以后无明显变化。综合考虑，脱色温度选择应＞30℃。

3.2 响应面试验结果

3.2.1 试验结果 以脱色率为评价指标优选工艺。试验设计方案及结果见表2。

表2 试验设计方案及结果Tab 2 Experimentaldesign and results

3.2.2 模型的建立及其显著性检验 利用Design-Expert7.1.6软件对表2中试验数据进行多元回归拟合，得到苦豆子多糖提取率对活性炭添加量（X1）、脱色时间（X2）、脱色温度（X3）的二次多项回归模型：脱色率＝13.775 00+20.250 00X1+1.412 50X2+0.050 000X3－0.215 00X1X2+0.115 00X1X3－7.250 00E－003X2X3－6.850 00X12－7.125 00E－003X22+2.375 00E－003X32。对该回归模型及其系数进行显著性检验，结果见表3。

表3 回归模型及方差分析结果Tab 3 Decolorization regression model and analysis of variance

由表3可知，回归模型的P＝0.0002＜0.01，添加量和脱色时间对脱色率影响极为显著，脱色温度对脱色率影响较显著。本试验得到的二次多项式模型具有高度的显著性，失拟项在P＝0.05水平上不显著（P＝0.492 4＞0.05），表明此模型的拟合度很好，能够准确预测和分析苦豆子多糖活性炭脱色工艺结果。

3.2.3 脱色工艺的响应曲面分析与优化 根据表3中结果绘制各因素间的三维效应图，详见图7。

由图7可看出，活性炭添加量、脱色时间和脱色温度之间的相互作用对苦豆子多糖脱色率影响不显著，活性炭添加量和脱色时间对苦豆子多糖脱色率的影响很大，随着活性炭添加量和脱色时间的增加，苦豆子多糖脱色率也随着相应的增加。经优化后得到的浸提工艺条件为活性炭添加量0.99%，脱色时间59.6m in，脱色温度40.3℃，其脱色率可达到66.4%。

3.3 工艺验证试验

在最佳脱色条件下进行3次验证试验，得到的多糖脱色率分别为66.9%、66.7%、66.2%，平均值为66.6%，与预测值的相对误差为0.30%；多糖损失率分别为6.42%、5.96%、6.12%，平均值为6.17%。证明响应面法优化苦豆子多糖脱色工艺是可行的。

4 讨论

在响应面优化的苦豆子多糖活性炭脱色工艺下可得到最佳的脱色效果，且多糖损失率低。活性炭为黑色细微粉末，无臭、无味，具有无毒、脱色效果好的特点，可以反复使用，成本低，适合工业化生产。

[1]史 伟，陈志国.苦豆子的开发与利用[J].草业与畜牧，2007，1：57.

[2]刘勇民.维吾尔药志（上）[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：259-299.

[3]和殿峰，李跟区，陈爱娜.正交试验优选鱼腥草多糖活性炭脱色工艺[J].中国药房，2009，20（6）：434.

[4]刘 敏，郭丽梅，张 丽.苯酚-硫酸法测定油松花粉多糖含量研究[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1 526.

[5]张善玉.天然产物多糖脱蛋白方法的研究[J].中国药房，2009，20（33）：2 633.