抗腹泻性贝毒软海绵酸多克隆抗体的制备与检测

胡乐琴，汪 卿，柳俊秀，何培民

（上海海洋大学水产与生命学院，上海 浦东 201306）

腹泻性贝毒素是多醚类赤潮藻毒素，其成分主要有软海绵酸（okadaic acid，OA）、鳍藻毒素（dinophysis toxins，DTX）。OA是蛋白磷酸酶PP1（Protein Phosphatase）和 PP2A（ser／thre Protein Phosphatase 2A）的特异性抑制剂，通过特异性地作用于蛋白磷酸酶PP1和PP2A抑制酶的去磷酸化，引起信号传导途径的变化，造成机体中毒［1］。OA还是肿瘤促进因子，可引致DNA加合物形成［2］。对水体和贝类产品进行毒素快速检测是预防藻毒危害的有效方法。

免疫学检测技术利用抗原与抗体专一、特异性结合的特点对样品进行检测，是一种高度灵敏高度特异的检测方法。1964年Johnson等首次成功制备了抗STX的多克隆抗体，后Adachi M等人［3］进入了藻毒素的单抗研究。目前市场上已经有几种藻毒素的免疫检测试剂盒和试纸条，用于藻毒素的快速检测。

关于大田软海绵酸单克隆抗体的制备在国内已有报道［4］，但尚未见到多克隆抗体的研究。有关大田软海绵酸多克隆抗体的制备与检测报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验动物：雄性新西兰白兔，体重为2～2.5kg，购自中国科学院上海生物研究所抗体中心。大田软海绵酸（OA）标准品购自北京伊普瑞斯科技有限公司。用甲醇稀释成100ng／μL贮存于-20℃冰箱备用；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），N-羟丁二酰亚胺（N-hydroxysuccinimide）、N，N双环乙烷碳二亚胺（N，N-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethy-formamide，DMF）、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、邻苯二胺（OPD）等为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记羊抗兔Ig-HRP和底物TMB-H2O2购于上海生工生物工程技术服务有限公司，GelDoc凝胶成像仪购自Bio-Rad，NC膜购自Sigma公司，TTBS购自Invitrogen-Dynal。

1.2 完全抗原的制备 OA与BSA偶联的方法是按参考文献［5］进行，仅将文献中的载体蛋白牛甲状腺球蛋白（BTG）改用牛血清白蛋白（BSA）。具体方法如下：取4.5mg N一羟丁二酰亚胺、9mg N，N-双环乙烷碳二亚胺溶于30mL MES缓冲液（0.05 mol／L，0.5mol／L NaCl，pH 值5.0），充分溶解，取50μL加入到100μL含1mg OA的DMSO溶液中，25℃反应15min；另称取3mg BSA，用500μL磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol／L pH 值7.4）溶解；将上述活化的OA和10μL吡啶加入BSA溶液中，在室温条件下轻速搅拌6h，再放置4℃冰箱过夜。第2天取出，分别用0.01mol／L pH值9.5的碳酸盐缓冲液和0.01mol／L pH值7.4PBS透析，分装、-20℃保存，用作免疫抗原。

1.3 偶联效果的检测 用乙醇精确配制OA标准溶液，用0.01mol／L pH值7.4PBS配制BSA的标准溶液。称取一定量的OA-BSA溶于PBS中，用Braford法测其蛋白质的浓度。根据此浓度调整OABSA溶液中蛋白质的浓度，使其与PBS一致。取2 mL OA溶液（10μg／mL）、取2mL BSA溶液（1mg／mL）和2mL OA-BSA溶液，以PBS为空白对照，用紫外分光扫描仪在波长200～500nm的范围内逐一扫描它们吸收光谱，在最大吸收峰处的波长测定吸光值，参照文献［6］估算OA与BSA的偶联比。

1.4 动物的免疫 取雄性新西兰白兔（体重为2～2.5kg）2只（07160＃和07161＃），按以下程序免疫。免疫流程：用OA-BSA与福氏佐剂混合，乳化后，皮下和皮内多点注射进行免疫。OA-BSA的剂量为0.6mg／次·兔。首次免疫用福氏完全佐剂，再次免疫用不完全福氏佐剂。免疫的间隔时间为3周。第3次免疫后1周，给兔放血，待血液凝固后放37℃温箱1h，然后4℃冰箱过夜。第2天用4℃低温离心机3000r／min收集上清液即为多克隆抗体。

1.5 抗体纯化 采用饱和硫酸铵法纯化抗体［6］，再用亲合层析柱进一步纯化。-20℃冰箱保存备用。

1.6 抗血清效价的测定-间接ELISA 间接竞争ELISA测定方法：包被抗原设置二组，一组包被抗原为OA-BSA；一组包被抗原为BSA。每个包被抗原做3个待测样品：免疫前血清；免疫后抗血清；免疫后抗血清加BSA中和。检测方法：用包被缓冲液将包被抗原稀释成2μg／mL的浓度，在酶标板每孔中加入100μL，做3个重复。密封后4℃ 过夜，弃去包被抗原，洗涤液洗涤3次，加入200μL封闭液37℃ 温育1h。每孔加入100μL待测抗血清，37℃温育2h，弃去抗血清，洗涤液洗涤3次；每孔加入100μL酶标二抗工作液（羊抗兔Ig-HRP），37℃温育1h，弃去酶标二抗工作液 ，洗涤液洗涤3次；每孔加入100μL底物溶液（TMB-H2O2），37℃避光显色15min后，每孔加入50μL 2mol／L H2SO4终止液终止反应，在酶标仪上读取450nm的吸光度值。

每组设置空白对照（本底），方法是以稀释液代替待测血清进行反应。

1.7 抑制率检测 先用甲醇溶解OA标准品，再用去离子水稀释成不同浓度OA稀释液，浓度分别为6.25、5、2.5、1.25、0.625、0μg／L，分别取各浓度标准品溶液50μL和血清稀释液50μL封闭孔内，竞争反应2h。其余步骤与间接ELISA法相同，测定OD值，计算达到50%抑制率时的OA质量浓度值（IC50值），确定单抗对OA的亲和性。抑制率的计算公式如下：抑制率=（1-OD450sam／OD450max）×100%

其中，OD450sam表示竞争性孔的OD值，OD450max表示未加药物抑制的孔的OD值。

1.8 Dot Blot检测OA-BSA兔抗血清特异性反应Dot-blot检测方法如下：将BSA、OA-BSA、OVA直接点于NC膜上，点样量均为0.2μg。用含5%脱脂奶粉的TTBS（w／v）溶液4℃封闭2h，滴加一抗（1∶～，用5%BSA in TTBS（w／v）稀释）4℃过夜。TTBS洗脱1min，重复洗脱4次。滴加二抗羊抗兔IgG（H+L）-HRP（1∶～），37℃孵育2 h，TTBS洗膜10min 4次，TBS洗膜10min，按ECL试剂盒说明进行显色，GelDoc凝胶成像仪采集图象。以PBS代替一抗作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 免疫抗原偶联效果 图1为OA-BSA免疫抗原偶联效果的紫外扫描鉴定结果。从图1可见，OA与BSA经DCC反应后，其产物OA-BSA的紫外吸收图谱与载体BSA相比，吸收峰和吸收曲线均发生了改变。其中，OA-BSA吸收峰在262nm处，与OA的吸收蜂相同，而BSA吸收峰在280nm处；OA-BSA的蛋白浓度与BSA相同，但OA-BSA最大吸收峰值大约是BSA两倍。可见OA与BSA已发生结合，且OA与BSA的结合率大约为18。

2.2 抗血清效价测定结果 ELISA检测多抗血清效价结果如表1。表1所示结果表明，来自07160＃和07161＃兔的抗血清中含有针对OA的抗体。因为用BSA中和后的抗血清，对BSA呈阴性反应，而对OA-BSA仍呈较强阳性反应。

2.3 抑制率测定结果 以吸光率B／B0（B是OA不同标准浓度的OD值，B0是OA（标准浓度的OD值）为纵坐标，以OA不同浓度×10的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线见图2，进行回归分析。经计算McAb对OA的IC50为2.852ng／mL。

图1 偶联物及产物紫外扫描图

图2 OA间接竞争ELISA工作曲线

2.4 Dot Blot结果 OA-BSA兔抗血清特异性反应检测结果如图3、图4。从图中可知，抗血清与BSA、OVA均无反应，而与OA-BSA有反应，说明抗血清为OA特异抗体。

表1 第3次免疫后兔抗OA抗体ELISA方法检测

3 讨论

酶免疫测定技术具有高度特异性和优良的稳定性，并且可以被开发成简便实用的试剂盒和试剂条，成为药物检测和毒素检测中具有研究和开发前景的热点，而获得高质量的抗体是实现免疫分析检测的核心和基础。

通常相对分子质量小于1，000的物质是不具有免疫原性的，需要与载体蛋白偶联形成结合物后才具有免疫原性。OA为多聚醚类小分子化合物，相对分子量为804.5，不具有直接产生抗体的特性，而需要偶联到大分子的载体上。目前，常用来作为小分子人工抗原的载体蛋白有牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、人IgG及人工合成的多聚赖氨酸（PLL）等。于光、卢士英［6］等（2006）将OA与人IgG偶联制备免疫原 OA-人IgG，其免疫效果很好。Shiro Matsuura［7］（1994）也采用人IgG作为载体制备免疫原OA-人IgG，用其研制的抗体建立的ELISA，最低的检测限为30ng／mL。Nuria M Llamas［8］（2007）用 OA 与牛甲状腺球蛋白偶联制备免疫原制备多抗，建立免疫生物传感器检测OA技术，OA50%抑制的质量浓度为148 ng／g。本文采用OA与BSA偶联制备免疫原，用其研制的多抗，经间接ELISA鉴定，OA50%抑制的质量浓度为2.852ng／mL，抗体质量较好，特异性反应强，可作为制备检测试剂的材料。

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［2］García C，Truan D，Lagos M，et al.Metabolic transformation of dinophysistoxin-3into dinophysistoxin-1causes human intoxication by consumption of o-acyl-derivatives dinophysistoxins contaminated shellfish［J］.J Toxicol Sci，2005，30（4）：287-296.

［3］Sako Y，Adachi M.Specific Monoclonal Antibodis and DNA Porbes for the Identification of the Toxic Dinoflagellate Genus Alexandrium［M］.Harmful marine algal blooms.Pairs：Technique ct documentation-lavoisier，intercept ltd，1995：77-81.

［4］卢士英，周玉，李岩松，等.大田软海绵酸单克隆抗体ELISA检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2007，27（3）：336-339，411.

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［6］杨利国，魏平华，郭爱珍，等.酶免疫测定技术 ［M］.南京：南京大学出版社，1998：279-281.

［7］Shiro Matsuur，Hiroshi Kita and Yutaka Takagaki.Specifity of mouse Monoclonal Anti-Okadaic Acid and Antibodies to Okadaic Acid and Its Analogs among Diarrhetic shellfish Toxins［J］.Biosci biotech biochem，1994，58（8）：1471-1475.

［8］Nuria M Llamas，Linda Stewart，Terry Fodey ＆.H，et al.Development of a novel immunobiosensor method for the rapid detection of okadaic acid contamination in shellfish extracts［J］.Anal Bioanal Chem，2007，389：581-587.