衍生自人ⅡA型磷脂酶A2碳末端的多肽C-26杀菌作用研究Δ

何睿林，梁宁生(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁市530021)

对于抗菌多肽(Antimicrobial peptides)的研究已有较长的历史，这类多肽对细菌和/或真菌都有杀菌作用。最初的研究主要集中在生物体内天然存在的抗菌多肽，无论是低等生物昆虫体内，还是高等生物哺乳动物体内，都存在这类物质，其是生物天然免疫系统里一类抵抗微生物感染的重要武器[1]。对抗菌多肽的研究有助于揭示生物抵抗感染的机制，也有助于抗感染药物的开发。

目前，除生物体内天然存在的抗菌多肽以外，抗菌多肽的研究还向2方面扩展:一是根据抗菌多肽的一些特性，利用计算机辅助设计和合成具有抗菌作用的多肽(非天然的)[2]；二是根据已知的一些蛋白分子结构，如血红蛋白分子结构，模拟合成这些分子的部分结构，也就是一些多肽片段，其也具有杀菌作用[3]。本研究是根据人ⅡA型磷脂酶A2(ⅡA型PLA2)分子的结构(全长为124个氨基酸残基)，合成其碳(C)末端26个氨基酸残基的多肽C-26。现对其杀菌作用进行初步研究。

1 材料

1.1 细菌

3种革兰阳性(G+)细菌:金黄色葡萄球菌(ATCC26003)、枯草杆菌(ATCC63501)、炭疽杆菌(ATCC63065)，3种革兰阴性(G－)细菌:大肠杆菌(ATCC44113)、变形杆菌(ATCC49027)、绿脓杆菌(ATCC10104)，以上标准菌株均由广西医科大学微生物学教研室提供，购自中国食品药品检定研究院。

1.2 试药

多肽C-26(由梁宁生教授设计，上海波泰生物公司合成和纯化，批号:10101321)；羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)、1%小牛血清白蛋白(北京Solarbio公司)；LB培养基粉(上海生工生物工程有限公司)；LB营养琼脂(北京陆桥技术有限责任公司)；无水氯化钙(CaCl2，成都科隆化工试剂厂生产，批号:20081106)；RPMI-1640培养基(美国Gibco-Brl公司)。

1.3 仪器

Anke TGL-16C台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；TU-1810S紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Thermo 420型恒温气浴摇床(新加坡Thermo Electron公司)；HWS-20恒温水浴箱(江苏太仓市实验设备厂)；J3-NAPCO-5410型CO2培养箱(克勒格瓦尼(上海)分析仪器有限公司)。

2 方法

2.1 不同哺乳动物ⅡA型PLA2氨基酸顺序(蛋白质一级结构)的获取与分析

根据本课题组先前的研究结果获取兔ⅡA型PLA2氨基酸顺序[4]，并利用美国国家生物工程信息中心(NCBI)网站的基因库(GenBank)，查询并获取所有已知的包括人、猩猩、猴、牛、豚鼠、大鼠和小鼠等7种哺乳动物的ⅡA型PLA2mRNA及其氨基酸顺序。人、猩猩、猴和牛的ⅡA型PLA2mRNA参考序列号(NCBI reference sequence)分别是NM_000300.3、XM_001160501.1、XM_001094969.1、NM_001025324，豚鼠、大鼠和小鼠ⅡA型PLA2mRNA基因获取号分别是GI:951010、GI:155369735、GI:132626632。同时，将各自氨基酸顺序的C末端26个氨基酸残基剪切并比较其氨基酸组成情况。

2.2 多肽C-26的制备与配制

以上述获取的人ⅡA型PLA2氨基酸顺序的C末端为模板，合成长度为26个氨基酸残基的多肽C-26(ARNKTTYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC)，纯度90%。多肽C-26使用前先离心将附壁的制剂粉末收集至管底以确保溶质的量，然后溶于经高压蒸汽灭菌的双蒸水400µL(10 g·L－1)，并以20µL/管分装于500µL Eppendorf管中，－20℃冷冻保存，尽量避免反复冻融。

2.3 杀菌试验

采用琼脂铺板计数法。(1)取过夜培养的细菌，按1∶50分别加入至5 mL新鲜LB培养液中(当细菌为金黄色葡萄球菌或绿脓杆菌时，加入量为300µL)，置于37℃恒温气浴摇床中振摇孵育2.5～3 h(对数生长期)。(2)采用台式离心机离心收集、洗涤细菌并将其沉淀物溶解于0.5 mL生理盐水，继以紫外分光光度计(波长540 nm)测出吸光度达到0.1时所需的细菌量(mL)，计算细菌稀释倍数。吸取多肽C-26和细菌(终浓度1×109cfu·L－1)各10µL，加入RPMI-1640反应体系(总体积为100µL，含有10 mol·L－1Hepes、1%小牛血清白蛋白、1 mol·L－1CaCl2，pH 7.4)，混匀后置于37℃恒温水浴。(3)水浴2 h后，从该体系中取出反应液50 μL，加灭菌生理盐水450 μL，连续10倍稀释，共4次。每一稀释倍数都取出100 μL的稀释液至无菌培养皿(直径55 mm)中，再加入经高压蒸汽灭菌后55℃保温的LB营养琼脂约5 mL，待琼脂冷却后，将培养皿放入37℃温箱培养。18～24 h后取出计算每一琼脂板上的菌落形成单位(cfu)，与未加入多肽C-26的对照组相比，计算经不同浓度多肽C-26作用后的杀菌率＝(对照组cfu－实验组cfu)/对照组cfu×100%，并绘制杀菌曲线。每组实验重复4次。

3 结果

3.1 不同哺乳动物ⅡA型PLA2蛋白质一级结构C末端分析

对获得的包括人、猩猩、猴、牛、兔、豚鼠、大鼠和小鼠等8种哺乳动物ⅡA型PLA2蛋白质一级结构进行分析表明，在其中的C末端26个氨基酸残基碱性最强，完全不含酸性氨基酸残基，却包含5～8个碱性氨基酸残基。所带的净正电荷在+5～+8之间，碱性氨基酸残基占据C末端26个氨基酸残基的百分比在19.23%～30.7%，提示该区域为碱性氨基酸富集区域。人或动物ⅡA型PLA2C末端26个氨基酸残基构成情况见图1。

3.2 多肽C-26对G+细菌的杀菌作用

多肽C-26在浓度为250 mg·L－1时即对同属G+细菌的金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草杆菌具有较强的杀菌作用，杀菌率在70%～99.9%，杀菌敏感性由高到低依次为:枯草杆菌＞炭疽杆菌＞金黄色葡萄球菌；当其浓度为500 mg·L－1(对炭疽杆菌)和1000 mg·L－1(对金黄色葡萄球菌)时，对炭疽杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率增加至99.9%以上。多肽C-26对G+细菌的杀菌作用详见图2。

3.3 多肽C-26对G－细菌的杀菌作用

多肽C-26浓度在500 mg·L－1时，对大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌3种G－细菌的杀菌率较为接近，在41%～52%之间，杀菌敏感性由高到低依次为:变形杆菌＞绿脓杆菌＞大肠杆菌。多肽C-26对G－细菌的杀菌作用详见图3。

4 讨论

4.1 多肽C-26的设计

已知的绝大部分抗菌多肽在结构上有一个共同的特点，就是带净正电荷，在多肽分子的组成中有较多的碱性氨基酸残基，较少或者没有酸性氨基酸残基[1]。本课题组先前对人ⅡA型PLA2的研究已注意到，ⅡA型PLA2分子组成中，也带有较多碱性氨基酸残基，所以分子带较多的净正电荷，其杀菌作用强度与分子携带的净正电荷成正相关[4]。因此，本研究以人ⅡA型PLA2为模板，分析其结构，选择ⅡA型PLA2分子中碱性最强的多肽片段。在ⅡA型PLA2分子的C末端，有1段长度为26个氨基酸残基的片段，约占模板分子1/5的长度，符合这一条件。其中，有8个碱性氨基酸残基，而没有任何酸性的，这一片段在已知的其他哺乳动物体内也高度保留，特别是其携带较多净正电荷的特性。另外，在ⅡA型PLA2分子的结构中，这一片段没有较复杂的结构，如α-螺旋或者β-片层结构，也较适合作为一个简单多肽合成。因此，本研究选择这一片段进行合成，并检测其杀菌作用。有学者曾根据蛇毒PLA2分子的C末端区域部分氨基酸顺序合成了抗菌多肽(长度为13个氨基酸残基)并进行研究，但考虑到蛇毒PLA2分子杀菌作用比人ⅡA型PLA2分子低1000倍以上[5]，且蛇毒PLA2分子的结构与人的有很大差别，作为药物很有可能产生抗原性，故选择人ⅡA型PLA2分子作为模板可能更为恰当。

4.2 多肽C-26的杀菌作用

本研究结果表明，多肽C-26对试验的G+细菌有较强的杀菌作用，其杀灭99.9%细菌的多肽浓度在250～1000 mg·L－1之间；对3种G－细菌的杀菌作用比较弱，当其浓度在500 mg·L－1时对三者的杀菌率相差不大，为41%～52%。之前本课题组对ⅡA型PLA2杀菌作用的研究表明，该分子对G+细菌有很强的杀菌作用，对G－细菌则很弱[4，6，7]。这提示多肽C-26与ⅡA型PLA2结构具有的类似性，决定了其杀菌作用的类似，因此其应该具有类似的杀菌机制。但是，本研究也注意到，多肽C-26的杀菌作用比ⅡA型PLA2分子明显偏弱，具体原因值得进一步探索。

4.3 多肽C-26的杀菌机制

前面提到，已知的绝大部分抗菌多肽在结构上有一个共同点，那就是有较多碱性氨基酸残基，分子带净正电荷。而在杀菌机制上，也与这一结构特点密切相关。细菌的细胞膜外层和内层都含有大量的酸性磷脂，如心磷脂和磷酸甘油，使得细菌的细胞膜带有大量负电荷，那些带有正电荷的抗菌多肽通过电荷的吸引力，结合到细菌的胞膜表面，进而插入细胞膜内层，使胞膜变薄和损坏，引起细菌死亡。由于高等生物是由真核细胞组成，而真核细胞的细胞膜的外层主要由不带电荷的中性磷脂组成，使得这类抗菌多肽不能有效地结合到真核细胞膜上，故对人等高等生物没有危害[1]。本课题组对ⅡA型PLA2的杀菌机制进行过研究，也发现其与抗菌多肽有类似的机制[8，9]。虽然本文尚未对多肽C-26的杀菌机制进行研究，但根据其结构特点，推测其应该也具有与其他抗菌多肽类似的杀菌机制，而具体的情况还有待进一步的分析。

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