肿瘤靶向超顺磁氧化铁纳米粒的小鼠急性毒性与抗吞噬性评价

高文慧，范彩霞，陈志良(1.南方医科大学南方医院药学部，广州市510515；.广东省粤北人民医院药学部，韶关市5106)

超顺磁氧化铁纳米粒(Superparamagnetic oxide iron nanoparticles，SPIO-NPs)是一种新型的磁共振造影剂，由于其所特有的小粒子、超顺磁性和低毒性等特点，在磁靶向给药和热疗等方面也具有突出的优势。当SPIO-NPs的粒径小于100 nm时，能逃避肝、脾的吞噬，达到全身分布，此时的纳米粒能进入淋巴系统，被淋巴结内的巨噬细胞吞噬；如果发生肿瘤部位的淋巴结转移，吞噬了SPIO-NPs的淋巴结正常组织的T2信号值将下降，而肿瘤组织的T2信号值不变，从而准确判断肿瘤是否转移以及转移肿瘤的位置和大小。在以上SPIO-NPs的包被材料上嫁接肿瘤细胞表面某些特异性受体的配体后，SPIO-NPs就能特异性结合肿瘤组织，使其T2信号值下降，与周围正常组织分清界限，确定肿瘤边缘及大小[1]。本课题组(肿瘤靶向新型磁共振造影剂的研制与体内、外评价课题组)现已合成了超小粒径的SPIO-NPs，并包被以羧甲基壳聚糖，以提高其溶液的稳定性和亲水性，再在羧甲基壳聚糖上嫁接以叶酸，由于大部分肿瘤表面具有叶酸受体，嫁接了叶酸的SPIO-NPs在体内能靶向结合有叶酸受体的肿瘤组织，从而达到靶向造影肿瘤组织的目的[2]。本实验旨在评价叶酸-羧甲基壳聚糖-SPIO-NPs(Folic acid-O-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles，FA-OCMCS-SPIO-NPs)和羧甲基壳聚糖-SPIO-NPs(O-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles，OCMCS-SPIO-NPs)的急性毒性，以及以葡聚糖-SPIO-NPs(dextran-superparamagnetic oxide iron nanoparticles，dextran-SPIO-NPs)为不能逃避肝、脾吞噬的阳性对照，评价2种造影剂的抗吞噬性，为将来动物体内的更深入研究打好基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HERMLE2360高速低温离心机(美国Thermo Scientific公司)；超滤离心管(10 kD，德国Sartorius公司)；CLZ型恒温磁力搅拌器(河南巩义予华仪器厂)；SK5200HL型超声粉碎仪(上海科导超声仪器有限公司)；Sephacrys-300HR凝胶(美国Pharmacia公司)；透析袋(截留相对分子量8000～15000，上海源聚生物科技有限公司)。

1.2 试药

FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs均由南方医院药学部科研组自制，含量以铁浓度表示，分别为18.46、18.67、20.32 mg(Fe)·mL－1，经测定，3种纳米粒的强均粒径分别为41.4、38.2、125 nm。

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、氨水、无水乙醇、二甲苯、盐酸、甲醛和亚铁氰化钾(广州化学试剂有限公司)；0.5%伊红溶液(凯基生物科技发展有限公司)；葡聚糖(分子量40000)、碳二亚胺(美国Sigma公司)；羧甲基壳聚糖(分子量10000～20000，脱乙酰化度≥93%，羧基取代度≥87%，青岛海普生物技术有限公司)。

1.3 动物

SPF级KM小鼠，体重(20±2)g，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号:SCXK(粤)2006-0015。

2 方法

2.1 3种纳米粒的制备

2.1.1 OCMCS-SPIO-NPs的制备。取摩尔比2∶1的FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，将二者溶解并混合，充氮搅拌下加适量氨水至pH约为11，升温反应1 h后磁性分离，并水洗4次，加入30 g·L－1碳二亚胺的磷酸盐缓冲溶液，超声分散，转入3%的羧甲基壳聚糖溶液中，超声反应1 h，产物离心30 min，取上清液过葡聚糖凝胶柱，收集首峰，蒸馏水透析24 h，超滤浓缩备用[3]。

2.1.2 FA-OCMCS-SPIO-NPs的制备。取蒸馏水透析过的OCMCS-SPIO-NPs，加一半体积的无水乙醇，高速离心，沉淀用无水乙醇、二甲亚砜各洗3遍，无水二甲亚砜超声分散备用。参考文献[4]方法合成叶酸活性酯，充氮加热下，将叶酸活性酯加入OCMCS-SPIO-NPs的无水二甲亚砜溶液中，反应4 h，产物蒸馏水透析24 h，超滤浓缩备用[2]。

2.1.3 dextran-SPIO-NPs的制备。将葡聚糖与摩尔比为2∶1的FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O充分混合，充氮搅拌下以碱性共沉淀法制备[5]。

2.2 急性毒性评价

取小鼠70只，分为空白组、FA-OCMCS-SPIO-NPs组和OCMCS-SPIO-NPs组，空白组10只，其它2组每组30只，♂♀各半。将2个给药组内的小鼠再平均分成高、中、低3个剂量组，每组10只，♂♀各半。有研究[6]发现，尾静脉给予昆明小鼠266.75 mg(Fe)·kg－1的SPIO-NPs后，出现短时少动现象，而最大给药剂量(438.5 mg(Fe)·kg－1)下，小鼠仍未出现死亡。本实验中SPIO-NPs经包被后理论上毒性会下降，故以278 mg(Fe)·kg－1为最低给药浓度，以1∶0.8为组间距设计3个浓度梯度组(即278、347.5、434.5 mg(Fe)·kg－1)，尾静脉一次性给药后，观察14 d内小鼠的死亡、饮食和体重变化情况。空白组尾静脉注射0.5 mL生理盐水，14 d后处死，观察心、肝、脾、肺、肾并拍照。2个给药组存活小鼠14 d后处死，从高、中、低3个剂量组中各取几只小鼠解剖，观察心、肝、脾、肺、肾并拍照。

2.3 抗吞噬性评价

在1.68～2.52 mg(Fe)·kg－1的给药剂量下，超小SPIO-NPs(粒径小于100 nm)在人体内的t1/2(24～36 h)远高于动物(2～3 h)，故动物实验多采用高剂量给药(11.2～56 mg(Fe)·kg－1)[1]。为了考察小鼠肝、脾对造影剂的吞噬作用，本实验中选取了较高的给药剂量(约56 mg(Fe)·kg－1)进行考察。

取♂小鼠20只，分成4组，每组5只，分别从尾静脉注射FA-OCMCS-SPIO-NPs(54.4mg(Fe)·kg－1)、OCMCS-SPIONPs(56.2 mg(Fe)·kg－1)、dextran-SPIO-NPs(57.6 mg(Fe)·kg－1)和生理盐水(0.2 mL)。24 h后，全部脱颈椎处死，取肝和脾于4%福尔马林溶液中固定24 h，石蜡包埋并做普鲁士蓝染色切片。以注射生理盐水的小鼠为阴性对照组，注射dextran-SPIO-NPs的小鼠为阳性对照组，依据肝、脾吞噬的SPIO纳米粒经普鲁士蓝染色后呈蓝色来评价2种造影剂抗肝、脾吞噬的能力。如果合成的2种纳米粒能逃避肝、脾的吞噬，则其与dextran-SPIO-NPs组相比，表现为染色后的切片上没有或者只有零星少许蓝色。

3 结果

3.1 急性毒性评价

FA-OCMCS-SPIO-NPs及OCMCS-SPIO-NPs的各给药剂量组相关情况如表1和表2所示。

表1 FA-OCMCS-SPIO-NPs各给药剂量组实验结果Tab 1Tests results of FA-OCMCS-SPIO-NPs groups of different doses

表2 OCMCS-SPIO-NPs各给药剂量组实验结果Tab 2Test results of OCMCS-SPIO-NPs groups of different doses

由于FA-OCMCS-SPIO-NPs组和OCMCS-SPIO-NPs组的小鼠均未出现死亡，依据新药临床前研究指导原则[7]，2种纳米粒的LD50＞434.5 mg(Fe)·kg－1，所有小鼠均未出现明显的毒性反应。14 d后处死小鼠，解剖并观察各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾，与空白组相比均未发现明显的组织损伤，详见图1、图2。

图1 给予OCMCS-SPIO-NPs 14 d后各给药剂量组小鼠各组织照片Fig 1Pictures of each tissue in each group after mice are injected with OCMCS-SPIO-NPs with different doses for 14 days

3.2 抗吞噬性评价

各组小鼠肝、脾普鲁士蓝染色切片照片见图3、图4。

图2 给予FA-OCMCS-SPIO-NPs 14 d后各给药剂量组小鼠各组织照片Fig 2Pictures of each tissue in each group after mice are injected with FA-OCMCS-SPIO-NPs with different doses for 14 days

图3、图4中各组织切片照片上箭头所指的点是被染成蓝色的SPIO-NPs。从这些切片图上可以清晰地看到粒径大于100 nm的dextran-SPIO-NPs(图3D、图4D)无法逃避肝、脾中巨噬细胞的吞噬，而粒径小于50 nm的FA-OCMCS-SPIO-NPs能完全逃避吞噬，OCMCS-SPIO-NPs则大部分逃避了吞噬。

4 讨论

2种新型磁共振造影剂的急性毒性结果显示，在最大给药剂量下，小鼠均无明显的毒性反应，表明其具有良好的安全性。FA-OCMCS-SPIO-NPs高剂量组中，小鼠表现出轻微的食欲减退，可能是由于嫁接叶酸以后纳米粒的粒径有所变大，毒性有所增加，也有可能是残留溶剂二甲亚砜的影响。本实验中SPIO-NPs包被以亲水性材料羧甲基壳聚糖后，静脉给药剂量达434.5 mg(Fe)·kg－1时也没有明显的毒性反应，这可能是因为包被材料后，纳米粒对体内细胞结构的破坏性减小，降低了超顺磁氧化铁的毒性。

粒径小于100 nm的超顺磁氧化铁理论上可以逃避肝、脾的吞噬，达到全身分布的目的，这样就可能对全身除肝、脾部位的肿瘤、血管及肿瘤淋巴结转移进行造影，打破了传统的超顺磁氧化铁只针对肝脏造影的现状，具有重要的研究意义。通过实验可知，2种磁共振造影剂均能逃避巨噬细胞丰富的肝、脾组织的吞噬。虽然肝、脾对OCMCS-SPIO-NPs有轻微的吞噬，但与dextran-SPIO-NPs相比，吞噬量很少，这与笔者之前体外评价巨噬细胞对FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMCSSPIO-NPs的吞噬结果相吻合[2，8]，这为今后考察二者的造影效果奠定了一定的基础。同时，二者又可以作为肿瘤靶向治疗的药物载体[9]，故对其研究具有巨大的应用前景。

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