HPLC检测他克莫司软膏剂中他克莫司的含量

2011-08-06李国辉李磊张厚才

成都医学院学报 2011年2期

李国辉,李磊,张厚才

(1.济南市妇幼保健院,山东济南 250001;2.山东省分析测试中心,山东济南 250014;3.月旭材料科技(上海)有限公司,上海 201203)

他克莫司(acrolimus)又名FK506,是从链霉菌属中分离出的发酵产物,其化学结构属23元大环内酯类抗生素,为一种强力的新型免疫抑制剂,主要通过抑制白介素-2(L-2)的释放,全面抑制T淋巴细胞的作用,较环孢素(CsA)强100倍。近年来,作为肝、肾移植的一线用药,已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明,其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时在治疗特应性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中发挥着积极的作用。目前市场有片剂、胶囊剂、注射剂、软膏剂等,其中软膏剂适用于因潜在危险而不宜使用传统疗法、或对传统疗法反应不充分、或无法耐受传统疗法的中到重度特应性皮炎患者。在软膏剂中辅料量多,主药量微,且主药理化性质较独特,含量测定较难。他克莫司软膏的含量测定目前已有报道[1],但是前处理不够彻底,基体干扰较大。本文采用SPE小柱对软膏基体进行净化,用Diol色谱柱进行分离,大大降低了基体的干扰,操作简单、快捷、专属性强,故该方法可用作他克莫司软膏剂的主含量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器:高效液相色谱仪(上海伍丰仪器,LC100二元高压系统,紫外检测器);色谱柱 Ultimate·XB-Diol(4.6 mm ×250 mm,5 μ m);Welchrom ·硅胶小柱(1 000 g/6L);1/1万电子天平(上海舜宇恒平);超声波清洗机(昆山超声波仪器厂)。

他克莫司对照品(中检所),他克莫司软膏剂(市场购买),乙腈(色谱纯,HoneyWell),正己烷(色谱纯,HoneyWell),正丁基氯(分析纯,国药集团),水(重蒸馏水)。

1.2 色谱条件

色谱柱 Ultimate·XB-Diol(4.6×250 mm,5 μ m);检测波长225 nm;流动相正己烷-正丁基氯-乙腈 7∶2∶1;温度室温;流速1.7 mL/min;进样量 :5 μ L 。

1.3 样品溶液的制备

供试样品溶液的制备:取他克莫司软膏样品1 g置于有封盖的离心管中,用5 mL(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液溶解、振荡,使之成为悬浊液,离心(3 000 r/min)5 min,取出上清液,向离心管中再次加入5 mL(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液,振荡,使之成为悬浊液,再次离心,取出上清液。合并两次上清液,将其通过活化的硅胶小柱后,用5 mL(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液洗涤6次。再用5 mL乙酸乙酯和5 mL乙腈依次洗脱,收集乙腈洗脱液,氮气吹干,残渣加入1 mL(正己烷-正丁基氯-乙腈1∶1∶1)混合溶液溶解即得。

硅胶小柱的活化:取1 000 g/6L硅胶小柱,用5 mL乙腈润洗,再用(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液每次5 mL冲洗两次,备用。

标准溶液储备液的制备:精密称取他克莫司对照品适量,用(正己烷-正丁基氯-乙腈 1∶1∶1)混合溶液溶解,配置成浓度为1 g/L的他克莫司标准溶液。

标准溶液的配制:精密量取他克莫司对照品储备液1 mL,用(正己烷-正丁基氯-乙腈1∶1∶1)混合溶液定容到10 mL,配置成浓度为0.1 g/L的他克莫司标准溶液。

阴性样品溶液:取不含他克莫司的阴性样品适量,按供试品溶液处理方法进行处理。

2 结果

2.1 色谱图

取他克莫司标准品溶液、他克莫司样品溶液和阴性样品溶液各20 μ L,按照1.2项条件测试,谱图如图1～3。

2.2 精密度实验

取他克莫司对照品溶液20 μ L,按照1.2项色谱条件,连续进样6针,计算其峰面积的相对标准偏差RSD为0.30%,说明该方法精密度良好。

2.3 重复性试验

取他克莫司软膏,按照1.3项方法,同时制备6份样品溶液,按照1.2项色谱条件,各取20 μ L进样测定,同时对照品溶液进行检测,按照外标法定量,6份样品检测结果平均含量为0.1007%,计算其相对标准偏差RSD为0.93%,说明该方法重复性良好。

2.4 稳定性试验

图3 阴性样品溶液Fig.3 Negative sample solution

制备他克莫司软膏样品溶液分别于0、1、2、3、5、6、8、10 h 检测 ,其峰面积没有明显的变化 ,其相对标准偏差RSD为0.49%,说明该样品溶液在10 h内稳定。

2.5 线性试验

取他克莫司对照品适量,用(正己烷-正丁基氯-乙腈1∶1∶1)混合溶液作为溶剂,配置成浓度分别为 2、5、10、50、70、100 、200 mg/L,按 1.3 项色谱条件依次分析各标准溶液,以峰面积(A)对进样量(μ g)得他克莫司的线性回归方程及相关系数分别为Y=2 600.7×-583.82,相关系数为0.999 9,线性范围为2 mg/L～200 mg/L。