约氏疟原虫17XL和17XNL感染小鼠组织病理学差异研究

付雍,丁艳,周桃莉,欧倩怡,徐文岳

(第三军医大学基础部病原生物学教研室,重庆 400038)

疟疾是全球三大传染病之一,每年有大约80万人死于疟疾,其中多数是5岁以下的儿童(WHO,2010)。在5种人疟中,恶性疟感染是导致疟疾患者死亡的主要原因。研究恶性疟感染引起死亡的分子机制将为我们提供新的治疗策略。但是,由于受伦理学的限制,重症疟疾许多重大机制的发现均来自于实验室鼠疟动物模型的研究。

约氏疟原虫 17XNL(P.y 17XNL)是兰多(Landau)[1]等1965年自中非共和国红树鼠(Thamnomys rutilans)体内分离获得的一种非致死株疟原虫,其在J.Finerty实验室常规传代中突然出现致死克隆,并由此分离得到致死株约氏疟原虫17XL(P.y 17XL)[2]。但是,目前对两种疟原虫感染致病机理还知之甚少,也没有感染导致的组织形态学差异的实验证据。因此,我们比较观察了P.y 17XL和P.y 17XNL感染小鼠的原虫率和存活率,以及感染对小鼠贫血、体重的影响和对脑部、脾脏组织结构的损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物与疟原虫感染

约氏疟原虫P.y 17XL株和P.y 17XNL株为本室长期保存。SPF级BALB/c小鼠(雌性,20g)由第三军医大学实验动物中心提供。实验分三组:正常对照组3只,P.y 17XL感染组和P.y 17XNL感染组各8只。感染组分别腹腔接种2×105个感染疟原虫P.y 17XL和P.y 17XNL的红细胞。

1.2 原虫血症,贫血和体重观测

从接种后第2天开始,每隔1 d称取小鼠体重1次,并取感染小鼠尾静脉血1滴制作薄血片,吉姆萨染色镜检计算原虫率。贫血指标为每毫升血液中红细胞的密度。

1.3 组织病理学观察

原虫接种6 d后,两感染组各随机挑选3只小鼠,以正常组为对照,麻醉后继以PBS和4%多聚甲醛先后灌流固定。取出小鼠脑和脾组织,4%多聚甲醛固定24 h,脱水、石蜡包埋、选择5um厚度连续切片,HE染色,光镜下观察各组织形态。

2 结果

2.1 P.y 17XL感染引起BALB/c小鼠死亡

在分别接种2×105个感染疟原虫红细胞后,P.y 17XL感染组小鼠原虫增值速度极快,在感染后4 d即达20%,6 d左右原虫率达到80%的峰值水平,并在感染后5～9 d内引起小鼠死亡。相比之下P.y 17XNL感染组小鼠原虫增值缓慢,在感染后9 d左右仅15%,随后原虫水平逐渐下降直至被清除,小鼠得以存活。

2.2 P.y 17XL感染使小鼠体重显著下降并引起严重贫血

感染后,在相同的饲养条件和环境中,P.y17XL感染组小鼠随时间的推移体型明显消瘦,从图2A、B中可以看出小鼠的体重和红细胞密度均呈现急剧下降的态势,与图1B相比可以发现,P.y 17XL感染组小鼠的体重和红细胞密度随原虫率的升高而急剧降低,在感染后原虫率达到峰值的第6 d体重丢失接近10%并引起严重贫血。而P.y 17XNL感染组小鼠接种后前6 d原虫增值缓慢,小鼠体重略有增重,在7-8 d时原虫增长出现峰值,此时小鼠体重也相应有所下降,随着原虫水平逐渐降低小鼠体重也趋于平稳。红细胞密度方面,P.y 17XNL感染组小鼠随着原虫的增值也会出现贫血现象,但在感染12 d后随着原虫的逐渐清除而开始恢复。

2.3 P.y 17XL感染疟原虫红细胞粘附于小鼠脑部微血管

原虫接种6 d后,脑部切片常规HE染色显示(图3):P.y 17XL感染组小鼠脑部毛细血管中发现有感染疟原虫红细胞的粘附和集聚(如箭头所示),而P.y17XNL感染组小鼠则没有。另外在两组感染组中没有观察到单核细胞在脑部微血管的浸润。

2.4 P.y 17XL和P.y 17XNL感染对小鼠脾脏组织结构的改变

脾脏是宿主抗疟原虫感染的主要免疫器官,感染疟原虫会引起脾脏组织结构的改变,而有研究报道脾脏结构的改变将影响宿主抗感染的免疫反应[3],比如降低抗疟原虫特异抗体亲和力等。我们对脾脏切片的观察显示(如图4),与对照组相比,两组感染组小鼠的脾脏都出现肿大的现象,并且P.y17XNL感染组小鼠脾肿大程度较P.y 17XL感染组小鼠更高,但是与P.y 17XNL感染组小鼠相比,P.y 17XL感染组小鼠脾脏白髓与红髓边界已经模糊不清。

3 讨论

重症疟疾严重危害疟疾患者的生命安全,典型症状为脑型疟,严重贫血和呼吸窘迫综合征(RDS)。了解重症疟疾发生的分子机制将有助于发展新的疟疾治疗手段。在本研究中,我们发现约氏疟原虫株P.y 17XL引起致死的原因可能与感染疟原虫红细胞在小鼠脑部微血管的粘附以及引起感染小鼠贫血有关。此外,P.y 17XL感染还导致小鼠脾脏组织结构的巨大改变,可能与其抑制宿主免疫反应而促进自身增殖有关。因此,P.y 17XL可以作为一种动物模型来研究重症疟疾的发病机理以及疟原虫的免疫逃避机制。

与P.y 17XNL不同的是,感染P.y 17XL可引起实验脑型疟的发生,表现为感染疟原虫红细胞(pRBC)在脑部微血管的粘附。另外,P.y 17XL感染引起的脑型疟与P.bANKA有所不同,表现为感染疟原虫红细胞在脑部微血管的粘附,但没有炎症细胞的集聚[4],这一点与恶性疟感染更为相似。因此,这种动物模型在成熟红细胞入侵生物学,感染疟原虫红细胞在脑部微血管的粘附以及对宿主抗感染免疫反应的调节等方面比伯氏疟原虫ANKA(P.bANKA)更接近恶性疟感染,所以这种动物模型可以用来深入研究脑型疟发生的分子机制。

在疟疾流行区,严重贫血是恶性疟感染引起的并发症之一,也是重症疟疾的重要特征之一。贫血的发生不仅与感染疟原虫快速增殖有关,而且有研究发现也与宿主的补体C3、吞噬细胞以及CD4+T细胞介导的对正常红细胞的清除有关[5,6]。从图1和图2可以看出,在P.y 17XL感染时,原虫血症快速升高的同时伴随着红细胞密度急剧下降,说明感染疟原虫红细胞发生溶血是导致感染小鼠严重贫血的主要原因。

已知P.y 17XL和P.y 17XNL对宿主免疫反应的调节存在差异,比如抗炎症因子TGF-β的分泌时间、CD4+CD25+Treg的激活[7]以及不同的IFN-γ[8]。脾脏在抗疟原虫感染的免疫反应中发挥着极其重要的作用,而疟原虫感染将引起脾脏组织架构的改变。在本研究中,我们发现P.y 17XL和P.y 17XNL两者感染虽然都引起小鼠脾脏肿大,但是P.y 17XL还导致脾脏红髓与白髓边界的破坏,反映出它们对宿主免疫反应调节的差异性。另外由于两者具有高度相似的遗传背景,还可以通过比较基因组学等方法鉴定P.y 17XL的致死成分及其机理。

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