2-型猪链球菌保护性抗原RfeA的B细胞表位预测

刘丽娜,潘渠,朱军民,丛延广,刘红美,李程

(1.贵阳医学院基础医学院医学生物技术教研室,贵州 贵阳 550004;2.第三军医大学基础医学院微生物学教研室,重庆 400038;3.重庆市永荣矿务局总医院病理科,重庆 402460)

猪链球菌(Streptococcus suis,SS)能引起猪脑膜炎、心内膜炎、败血症、多关节炎、多浆膜炎、肺炎和突然死亡,是造成世界养猪业重大经济损失的主要病原之一。目前已知的35个血清型中,血清2型的致病力最强、流行范围最广,可感染人。1998年和2005年大规模爆发人感染2-型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的严重公共卫生事件[1],迫使我们必须加强对SS2感染的预防和控制。实践证明疫苗预防是消灭和控制传染病的有效手段之一[2],但是迄今仍无有效预防SS2感染的疫苗。

表位疫苗(Epitope vaccine)是用抗原表位制备的疫苗,包括合成肽疫苗、重组表位疫苗和表位核酸疫苗,是目前有关传染性疾病和恶性肿瘤疫苗的研制方向[3]。通常仅由一种抗原肽制备的疫苗,诱导的免疫保护作用较弱,含有多种B细胞或T细胞表位的多表位疫苗,可诱导更好的保护力。发展多表位疫苗有利于提供更完全更有针对性的免疫保护。另外,对抗原表位的研究,将深层次地揭示蛋白抗原诱导免疫应答的分子机制。

笔者在前期研究工作中,证实了RTX家族胞外蛋白A(RTX family exoprotein A,RfeA)能提供小鼠抵抗SS2高致病力菌株致死性攻击的保护力,是SS2新的保护性抗原[4],对RfeA的进一步研究将有助于SS2疫苗的研制。本研究通过生物信息学方法对RfeA的B细胞表位进行分析和预测,为开展SS2多表位疫苗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 SS2保护性抗原RfeA的氨基酸序列

SS2全基因组序列测定和推定氨基酸序列参见文献[5],RfeA含有186个氨基酸残基。

1.2 SS2保护性抗原RfeA的二级结构柔性区域预测

用Garnier-Robson法[6]、Chou-Fasman法[7]和Karplus-Schulz法[8]预测RfeA二级结构中的柔性区域。

1.3 SS2保护性抗原RfeA的B细胞表位预测

用Kyte-Doolittle法[9]分析 RfeA的亲水性,用Emini法[10]预测 RfeA的表面可能性,用 Jameson-Wolf法[11]预测RfeA的抗原性指数,综合分析上述各方法的预测结果,最终推测RfeA的B细胞抗原表位。

2 结果

2.1 RfeA蛋白预测的二级结构柔性区域

按Garnier-Robson法预测的结果见图1,按Chou-Fasman法预测的结果见图2,按Karplus-Schulz法预测的结果见图3,同时被3种方法预测为柔性结构的区域很可能就是RfeA蛋白的二级结构柔性区域。综合分析图1、图2和图3,RfeA蛋白的二级结构柔性区域位于 N-端的第 6～8、32～35、54-58、67～ 69、74～ 76、112～ 115、152～ 155。

图6 RfeA蛋白的抗原性指数Fig.6 Antigenicity index for RfeA

2.2 RfeA蛋白的B细胞表位预测结果

采用 Kyte-Doolittle法、Emini法和 Jameson-Wolf法分别预测RfeA蛋白的亲水性、表面可能性和抗原性指数,结果见图4-6。经抗原性指数、蛋白质表面可能性指数和亲水性指数筛选出的氨基酸区段中(抗原性指数≥0,表面可能性指数≥1,亲水性指数≥0),如果其内部或附近又具有柔性结构,则很有可能为B细胞表位。综合分析上述预测结果,RfeA 蛋白 N-端第 21～ 27、53-60、104～ 117、140～ 160 区段很有可能存在B细胞表位。

3 讨论

表位的鉴定是构建表位疫苗的第一步。目前有多种方法用于抗原表位的实验检测和理论预测,如根据蛋白质一级结构预测法、化学“切割”法或酶法、肽探针扫描技术(交叠合成多肽的方法)、噬菌体展示技术、Ag-Fab复合物的X射线衍射和核磁共振(NM R)分析等[12]。根据蛋白质一级结构预测法具有简单、直观、快速等优点,被广泛应用于疫苗研究[13-15]。因此,本研究采用蛋白质一级结构预测法来预测蛋白质的B细胞表位。

有效的保护免疫取决于一组表位的合理组合与搭配。抗原表位、连接方法、表达系统以及表位的加工效率都会影响到多表位疫苗的免疫效力,而且在设计表位疫苗时,还应根据机体对疾病的免疫应答特点及免疫保护机制,合理选择特异性B细胞表位、Th表位或CTL表位来定向诱导宿主的B细胞应答、Th应答或CTL应答,或者采用多种类型的表位组合,同时诱发体液免疫和细胞免疫[12]。在前期的研究工作中,我们证实了RfeA能刺激小鼠机体产生较强的免疫应答,以体液免疫为主,能有效保护小鼠免受SS2高致病力菌株的致死性攻击[4]。因此,在设计以RfeA为基础的多表位疫苗时,选择特异性B细胞表位,定向诱导宿主的B细胞应答。

通常蛋白质的二级结构与蛋白质的表位分布有较大关系。转角和无规则卷曲区域的结构比较松散,易于发生扭曲、盘旋,并展示在蛋白分子表面,成为抗原表位的可能性较大。此外,蛋白质分子的亲水性、表面可能性、柔韧性和抗原性等也与其抗原表位构成有密切的联系。因此,本研究将蛋白亲水性、表面可能性以及抗原指数的预测结果与二级结构中柔性区域的分析相结合,综合判定含有B细胞表位的区段。通常使用单一方法和参数进行抗原表位的预测正确率不高,一般将多种方法和多参数分析的结果进行综合,这样可提高预测的准确性和可信性。

本研究通过生物信息学方法预测了RfeA的B细胞表位,为设计SS2的多表位疫苗和实验验证疫苗免疫效力奠定了基础。

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