GRP78/Bip在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗中的表达△

张延平 张晓强 刘雅丽 黄玮 孙玉蕊

1 中国人民解放军第309医院耳鼻喉科(北京 100091); 2 河南省医学情报研究所; 3 河南省卫生厅

GJB2基因编码缝隙连接蛋白26(connxin 26,Cx26),该基因突变是导致非综合征型聋(nonsyndromic sensorineural hearing impairment,NSHI)的主要原因。目前GJB2基因突变导致耳聋的机制还不完全清楚。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否参与了其致聋过程目前未见报道。GRP78/Bip即葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein,GRP78),又名免疫球蛋白重链结合蛋白(the immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip),是一种内质网分子伴侣,在ERS出现时其表达上调,被认为是ERS的特异性标志物之一[1]。为了探讨ERS与NSHI的发病是否有关,本研究检测了不同发育阶段GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗组织中GRP78/Bip表达水平,为进一步研究NSHI的致病机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 GJB2基因条件敲除小鼠cCx26loxp/loxp;Pax2 Cre/+(cCx26)(实验组,6只)由转基因小鼠Cx26loxp/loxp与 Cx26loxp/-;Pax2 Cre/+小鼠(均由美国Emory大学林曦教授实验室提供)杂交获得,野生型BALB/c小鼠(6只)作为正常对照组。动物统一编号,统一喂养,双盲法测定,两组分别选取P8、P12和P21三个发育阶段各小鼠2只进行实验。

1.2 实验方法 试剂分别为磷酸盐缓冲液(PBS,Merk,德国)、多聚甲醛(Merk,德国)、T riton X-100(Sigma,美国)、羊抗鼠 GRP78多克隆抗体(Santa Cruz,美国)、罗丹明抗羊二抗(Jackson,美国)、含DAPI的封片剂(Invitrogen,美国)、解剖显微镜(Olympus,日本)、冰冻切片机(樱花,日本)、激光共聚焦显微镜(LSM 510,Zeiss,Jena,德国)等。

1.2.1 耳蜗切片 动物戊巴比妥腹腔注射麻醉后,剪开胸骨,暴露心脏进行心脏灌注,断头取耳蜗,在解剖显微镜下,用分离针把蜗尖挑开一小孔,挑破圆窗膜,取出镫骨,用细玻璃吸管将4%多聚甲醛由蜗尖小孔灌注,使固定液经前庭阶、鼓阶从前庭窗和圆窗流出,然后把标本放入该固定液里4℃冰箱内固定过夜。10%EDTA充分脱钙,PBS缓冲液漂洗后,20%蔗糖溶液过夜,然后OCT过夜,定向包埋后,-20℃条件下7 μ m切片。

1.2.2 GRP78/Bip表达检测 采用免疫组化方法检测耳蜗组织中GRP78/Bip表达。耳蜗切片用含0.1%的Triton X-100的PBS(PBST)室温漂洗30 min,加5%山羊血清室温封闭 1 h,一抗(1：200稀释)4℃染色过夜,PBST漂洗三次,每次10分钟,加二抗(1：200稀释)室温1 h,PBST再次漂洗三次,封片,激光共聚焦显微镜观察。

2 结果

2.1 cCx26小鼠耳蜗形态学观察结果 P8时cCx26小鼠耳蜗Corti器尚未发育成熟,内外隧道均未形成,形态与对照组无明显差异(图1的a1、b1、c1);到P12时,对照组小鼠内耳发育接近成熟,开始出现比较明显的Corti器结构,而cCx26小鼠耳蜗Corti器仍为一团细胞,未见明显正常结构,血管纹、盖膜、螺旋韧带等结构发育与对照组相比无明显差异(图2的a1、b1、c1)。P21时cCx26小鼠耳蜗与野生型相比出现较明显的差异,cCx26小鼠在中回和底回Corti器缺失,仅余单层细胞,顶回Corti器尚存多层细胞,形成与P12类似的细胞团,未形成明显的正常结构(图3的a1、b1、c1)。

2.2 GRP78/Bip的表达 P8时GRP78/Bip在盖膜、Crti器细胞的细胞膜上表达明显,而在耳蜗外侧壁表达较弱,在螺旋神经节细胞未见明显表达(图1的a2、b2、c2)。P12时,GRP78/Bip上述阳性表达部位表达减弱,而且阳性部位也由P8时的细胞膜转移至细胞浆(图 2的 a2、b2、c2)。到 P21时,GRP78/Bip表达的位置与P8时相同,但表达强度明显增强,在盖膜、Corti器、耳蜗外侧壁可见到明显的表达,而螺旋神经节细胞仍未见明显着色(图3的a2 、b2 、c2)。

图1 P8敲基因小鼠与野生型小鼠耳蜗Co rti器形态及GRP78/Bip表达 a1、b1和c1为敲基因小鼠,a2、b2和c2为野生型小鼠

与野生型小鼠相比,GRP78/Bip在cCx26小鼠耳蜗的表达定位与野生型相同,但在P8和P12时cCx26表达更强(图1、2中的 a1、b1、c1),到P21时,在盖膜、耳蜗外侧壁GRP78/Bip表达较野生型减弱,而在顶回仅存的不成熟 Corti细胞团中,GRP78/Bip表达与野生型接近(图3的a1、b1、c1)。

3 讨论

内质网是细胞内重要的细胞器,参与蛋白质合成、折叠和寡聚化、脂类代谢、胆固醇代谢和钙的储存,其功能的实现依赖内质网中众多的伴侣蛋白、较高的钙离子浓度及其氧化环境的保持等。当蛋白糖基化抑制、二硫键生成障碍、钙稳态失衡、氧化状态丧失、缺氧/缺血及某些药物作用等造成未折叠或折叠异常蛋白质在内质网内大量堆积时,均会导致内质网应激反应,细胞通过启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),降低蛋白合成速率,减轻内质网负担,上调内质网伴侣蛋白表达等机制,以恢复细胞内环境稳态;但如果应激刺激过于强烈、持久,内环境紊乱无法纠正,则相应凋亡机制被激活以诱导细胞发生凋亡[2,3]。

正常小鼠出生时耳蜗发育尚未成熟,出生后继续发育,大约在P9时Corti隧道、外隧道等结构逐渐形成,到P14时发育完全成熟。而研究发现cCx26小鼠直到P30,其Corti隧道及 Neul's间隙还未形成,从P13开始出现耳蜗支持细胞凋亡,P16时耳蜗中回Corti器变为正常单层细胞,P30时中回Corti器单层细胞也开始消失,而直到P30耳蜗顶回的Corti器形态一直保持细胞聚集状态[4],与本研究结果基本一致。本研究结果还提示,GRP78/Bip在cCx26小鼠耳蜗的表达定位与野生型小鼠相同,但在P8和P12时cCx26小鼠的表达更强,到P21时,在盖膜、耳蜗外侧壁GRP78/Bip表达较野生型小鼠减弱,而在顶回仅存的不成熟Corti细胞团中GRP78/Bip表达与野生型接近,提示GRP78/Bip表达增高发生在小鼠出生后耳蜗发育成熟和听觉成熟之前,发生在内耳细胞缺失之前,提示ERS可能与GJB2突变导致的耳聋相关。

GJB2突变导致耳聋的原因还不完全清楚,目前公认的学说主要有两种：一是GJB2突变导致内耳钾离子循环受阻,在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗,由于缺乏Cx26,局部钾离子显著增加,导致位于内耳支持细胞上的谷氨酸转运体(glutamate transporter,GLAST)功能异常,造成谷氨酸的逆向转运,使细胞外谷氨酸聚集,抑制了抗氧化物谷胱甘肽的合成,最终导致氧化应激[5];第二种学说是缝隙连接介导的营养物质转运受阻,该学说提出内耳感觉上皮是无血管器官,可能主要通过内耳支持细胞之间形成的缝隙连接供给营养维持细胞内环境的稳定,也就是说内耳支持细胞传输葡萄糖,依赖于具有正常功能的缝隙连接,当内耳主要的缝隙连接蛋白Cx26和Cx30之一缺失时,支持细胞传输葡萄糖类似物(non-metabolizable D-glucose analogue,2-NBDG)显著减少,提示在缝隙连接基因突变后,内耳细胞可能处于缺乏能量状态[6]。上述两种学说最终都可能导致内耳细胞内蛋白质合成障碍,导致异常多肽大量堆积内质网中,激活ERS以及后续的UPR导致细胞凋亡,从而导致耳聋。研究发现体外构建的中国人常见 GJB2突变表达载体转染HEK293细胞后,突变蛋白滞留在内质网中,提示ERS及其相关凋亡通路可能与GJB2突变导致的耳聋相关[7]。本研究的结果可见在 P8和 P12时,cCx26小鼠耳蜗GRP78/Bip表达强于对照组小鼠,在听觉功能成熟之前的P12这种差异更加明显,提示在GJB2基因条件敲除小鼠出生后听觉器官进一步发育的过程中,由于缺乏缝隙连接,蛋白合成可能已经受到影响,使ER内堆积了大量错误折叠或未折叠蛋白,导致 ERS激活,GRP78/Bip表达增加。而在P8时内耳细胞虽然形态尚未出现变化,但是潜在的变化已经开始,这一情况到了听觉发育成熟前夕的P12更加显著,机体通过一系列的信号反馈机制使分子伴侣合成增加试图扭转这一局面,但在听觉发育开始时发生的一系列变化使已经存在的ERS更加激烈和持久,机体无法挽回内环境的失调,终于激活了相关细胞凋亡通路,导致内耳细胞的缺失,致动物耳聋。因此ERS可能参与了GJB2基因突变导致的非综合征型聋的发生过程,但ERS相关信号分子在cCx26小鼠耳聋发病中的具体作用还需要进一步的研究。

(致谢：本实验在中国农业大学国家饲料工程技术研究中心完成,在此向给与本研究帮助的李德发教授、尹靖东教授、董冰教授和马红老师致以衷心的感谢!)

1 Lee AS.The ER chaperone and signaling regulator G RP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress[J].Methods,2005,35：373.

2 Fairn GD,Grinstein S.Cell biology.A one-sided signal[J].Science,2008,320：458.

3 Bredesen DE,RaoRV,Mehlen P.Cell death in the nervous system[J].Nature,2006,443：796.

4 Wang Y,Chang Q,Tang W,et al.Targeted connexin26 ablation arrests postnatal development of the organ of Corti[J].Biochem Biophy s Res Commun,2009,385：33.

5 Cohen-Salmon M,Ott T,Michel V,et al.Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death[J].Curr Biol,2002,12：1 106.

6 Chang Q,Tang W,Ahmad S,et al.Gap junction mediated intercellular metabolite transfer in the cochlea is compromised in connexin30 null mice[J].PLos ONE,2008,3：e4 088.

7 Zhang Y,Wang J,Li L,et al.Three common GJB2 mutations causing nonsyndromic hearing loss in Chinese populations are retained in the endoplasmic reticulum[J].Acta-Otolaryngologica,2010,130：799.