Ⅱ型胶原酶体外分离并培养成年小鼠血管纹边缘细胞*

王燕 褚汉启 周良强 陈金 李志勇 刘云 张平 王春芳 黄孝文 崔永华

1 华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科(武汉430030);△现在武汉市妇幼儿童保健中心(武汉市儿童医院)耳鼻咽喉头颈外科

研究表明血管纹区域是转运K+进入内淋巴和产生耳蜗内电位的重要部位[1,2],其中最主要的功能活性细胞边缘细胞(marginal cell,MC)是内淋巴产生和调节的关键,并参与了蜗内电位的形成和维持。KCNQ1为近年研究发现的分布于血管纹边缘细胞膜上的三种转运K+的通道蛋白之一[1～3],已发现该通道蛋白功能异常与多种心律失常、遗传性聋等疾病的发生有关[4],其在耳蜗内主要分布于边缘细胞,除参与并维持耳蜗K+循环的作用外[5],亦可认为是边缘细胞的特异性标志蛋白。由于内耳结构复杂及血管纹边缘细胞包裹于骨性蜗壳中,取材困难,所以边缘细胞在内耳听力相关性疾病中的病理生理作用尚不清楚。本实验采用原代消化培养方法,建立成年小鼠血管纹边缘细胞体外分离培养体系,为进一步研究成年期边缘细胞的生理特性、病理生理功能以及相关通道蛋白在耳蜗内电位(endocochlear potential,EP)形成及K+循环中的作用和地位提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生75±3 d的健康C57BL/6J小鼠6只,体重30～35 g,雌雄不限,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。

1.2 实验试剂 MEM培养基(Hyclone)中加入15%胎牛血清(Gibco)、氢化可的松0.4 mg/L(Sigma)、表皮生长因子10 ng/ml(Chenkon)、0.02%EDTA 、0.25%胰蛋白酶(Gibco)、胶原酶Ⅱ(invitrogen)。多聚赖氨酸(Sigma),兔抗小鼠角蛋白18(CK18)单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),兔抗小鼠KCNQ1多克隆抗体(Santa Cruz),羊抗兔IgG(SABC-cy3)试剂盒,羊抗兔IgG(SABC-FITC)试剂盒(武汉博士德)。Trizol(Invitrogen),RT-PCR试剂盒(Takara),CK18、KCNQ1及内参β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 血管纹边缘细胞的分离、纯化与培养 6只成年小鼠采用颈椎脱臼法处死,浸入装有75%乙醇的烧杯中消毒5 min,移入冰冻PBS液中进行解剖：断头,沿中线剪开颅骨,去除大脑及周围组织,分离出双侧听泡。在解剖显微镜下,分离出血管纹组织,将其剪成小块状转移至离心管,加入0.2%Ⅱ型胶原酶于37℃培养箱消化30 min,然后 800 r/min离心5 min,弃上清,沉淀重悬于含15%胎中血清(FBS)的MEM 培养基中,收集细胞悬液转移至用多聚赖氨酸预先包被的六孔板中,加入适量完全培养基,置5%CO2、37 ℃培养箱中。24 h后换液,以后每2天或视细胞生长情况换液。每天用倒置显微镜观察细胞形态和生长的基本情况。采用选择性消化法和差速贴壁法进行细胞纯化[6,7]。

1.3.2 细胞生长曲线的测定 将细胞以每孔5×103个细胞接种于多聚赖氨酸包被的96孔细胞培养板中,每孔体积200 μ l,置于培养箱内培养。分别于培养第1～15天隔日加入MT T溶液(5 g/L)20 μ l,37℃继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养基,每孔加入 150 μ l DMSO,振荡 10 min 后,以492 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值。每组设 3个复孔,重复3次,以不加细胞仅加培养基的孔为空白对照孔。以时间为横轴,A值均值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.4 培养细胞的鉴定

1.4.1 透射电镜观察 取纯化后的细胞以0.25%胰蛋白酶消化,完全培养基终止消化,收集细胞悬液,800 r/min离心5 min,弃上清,2.5%戊二醛固定,常规制作透射电镜标本并观察。

1.4.2 免疫荧光细胞化学检测细胞角蛋白18(CK18)和KCNQ1的表达 取纯化后的细胞爬片,4%多聚甲醛固定30 min,0.01 mol/L PBS溶液洗3 min×3次;0.25%tritonⅩ-100破膜 15 min,5%BSA封闭 20 min,分别加 CK18(1∶100)、KCNQ1(1∶200)抗体,4℃湿盒过夜,室温复温30 min,PBS洗 3 min×3次,分别滴加cy3标记的羊抗兔IgG(1∶100),FITC标记的羊抗兔IgG(1∶100),室温孵育60 min,PBS洗3 min×3次,DAPI染核,防淬灭剂封片,激光共聚焦显微镜观察拍照。PBS代替一抗作阴性对照。

1.4.3 RT-PCR检测CK18和KCNQ1 mRNA的表达 取纯化后MC,PBS清洗去除培养液,按Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA,再逆转录合成cDNA。取逆转录产物为模板,进行PCR反应,反应体系(20 μ l)：cDNA 1 μ l,Taq Mix 10 μ l,超纯水7 μ l,上游引物 1 μ l,下游引物 1 μ l。CK18 的上游引物 ：5′-GATCAGGCAGCTGAGGACAGA-3′;下游引物：5′-TGAGCT TGGAGACCT TGGAT-3′,扩增产物大小为235 bp;KCNQ1扩增的上游引物：5′-CGTGTACCACTTCACCGTCT T-3′,下游引物：5′-GAGGCGGACCACATATTCTG-3′,扩增产物大小为 157 bp;内参β-actin基因,上游引物 ：5′-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3′,下游引物 ：5′-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3′,扩增产物大小为249 bp。扩增条件为：94℃预变性10 min,94℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸1 min,共循环30次,72℃再延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察拍照,打印。

2 结果

2.1 培养的MC生长特性和形态特点 培养24～48 h后,在倒置显微镜下可见有细胞贴壁和增殖,呈不规则多角形,形成大小不等的“细胞岛”(图1);5～8天后,多角形细胞迅速生长,增殖快,以后逐渐进入平台期,少量成纤维样细胞在其外周生长;12～14天时大量增殖的细胞互相抵触,紧密排列,形成上皮单层,呈上皮细胞典型的“铺路石”样外观(图2),并可见由数百个 MC密集生长组成的折光性强的球形结构(dome);在培养第20天左右,细胞出现拉丝、拉网现象,胞质内出现空泡。MC的生长曲线见图3。

2.2 培养细胞的电镜观察及KCNQ1通道蛋白的的表达情况 透射电镜观察可见细胞胞浆内线粒体、内质网等细胞器丰富,单核,呈卵圆形并可见分叶,细胞表面有较多微绒毛,细胞间连接紧密,符合上皮细胞特征(图4);激光共聚焦检测显示培养的细胞CK18蛋白表达阳性(图5),细胞胞质可见红色荧光,细胞核呈蓝色;KCNQ1通道蛋白表达于细胞膜上,呈绿色荧光(图6);阴性对照细胞无着色,仅见蓝色细胞核;对培养细胞提取总RNA,OD260/OD280的比值为1.75,RT-PCR的产物：CK18为235 bp的片段,KCNQ1为157 bp的片段,β-actin为 249 bp(图7、8)。

图7 培养细胞的CK18mRNA RT-PCR电泳图 M—marker;1-β-actin;2-CK18

图8 培养细胞的KCNQ1mRNA RT-PCR电泳图 M—marker;1-β-actin;2-KCNQ1

3 讨论

耳蜗血管纹具有特殊的组织结构,血供丰富,由三层细胞和血管纹间隙(又称纹间区,intrastrial space,IS)组成,三层细胞分别为边缘细胞(marginal cell,MC)、中间细胞(intermediate cell,IC)和基底细胞(basal cell,BC)。边缘细胞紧邻中阶内淋巴,以紧密连接蛋白相连接,不但参与K+向内淋巴液的跨膜转运,在形成内淋巴高K+和维持耳蜗内电位中起重要作用外,还参与内外淋巴屏障的构成。因边缘细胞所在的血管纹位于耳蜗深处,且成年鼠耳蜗骨化明显,血管纹分离取材更加困难,不利于对边缘细胞的活体分离研究,而体外细胞培养可以克服这种缺点,故本研究采用Ⅱ型胶原酶消化法体外分离培养成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞。

与其它实验动物相比,小鼠是目前世界上用于研究转基因和基因敲除最多的动物,尤其是敲基因和某些基因自然变异而导致的听觉障碍与人类极为相似,因此小鼠逐渐替代豚鼠等实验动物广泛应用于听觉系统的研究。1989年Rarey等首先报道应用消化法成功培养了牛的耳蜗血管纹边缘细胞,此后,Kim等[8]报道用豚鼠、沙鼠和大鼠采用血管纹组织块法培养出MC,并通过形态学、免疫组织化学和电生理学研究,初步观察了培养的MC的结构特征和功能特性,但未见小鼠血管纹边缘细胞培养的报道。在组织水平对MC的在体研究发现,不同年龄段边缘细胞的某些功能蛋白的表达有差异,如Na、K-ATPase在小鼠耳蜗的表达于出生后1个月才达到成熟水平[9],且其活性随着鼠龄增加而逐步减退[10],血管加压素受体V2在成年大鼠耳蜗未检测到其表达,而新生大鼠耳蜗则有表达[11]。本研究取材于成年小鼠,采用消化法建立耳蜗血管纹边缘细胞培养体系,旨在为进一步研究成年期小鼠血管纹边缘细胞的生理病理特性提供实验细胞。

由于耳蜗血管纹组织分离的困难性,目前边缘细胞的培养主要采用组织块贴壁法和胰酶消化法,组织块贴壁法虽操作简单,但在边缘细胞生长的同时,亦有较多的杂质细胞如成纤维细胞、间质细胞等生长,影响边缘细胞的成长及纯度;胰酶消化法是目前细胞培养研究中最常用的一种方法,但其消化作用较强,对细胞成分和活性的影响大[12]。而本研究选用Ⅱ型胶原酶进行血管纹边缘细胞的原代消化培养,其优点在于Ⅱ型胶原酶作用温和,有较好的细胞间质消化功能,而上皮类细胞对其又具有一定的耐受性,可将上皮类细胞与细胞间质成分相分离而不损伤上皮类细胞。国外很多学者在原代培养上皮细胞的研究中,均应用了胰岛素、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白、表皮生长因子等成分促进细胞体外生长,但价格昂贵。本研究中仅使用了MEM、FBS、表皮生长因子成分,采用消化法仍培养出大量的MC,而且细胞代谢旺盛,生长良好,免疫荧光检测可见培养细胞表达上皮细胞的标志性蛋白CK18,且RT-PCR也检测到培养的细胞表达CK18 mRNA,与其他研究者观察到的边缘细胞生长特点、结构特征以及生物学特性一致,证实所培养的细胞为上皮来源的血管纹边缘细胞。由于成纤维样细胞相对较上皮类细胞容易贴壁[13],先吸附在瓶壁上,经过多次贴壁选择后,细胞悬液中剩下的主要是边缘细胞,故在边缘细胞的纯化方面,本研究采用选择性消化法和差速贴壁法,可使细胞的纯度达到95%以上。

KCNQ1通道蛋白是一种电压依赖性门控钾通道蛋白,由位于染色体11p15.5的KCNQ1基因编码,主要分布于内耳、心脏、肾脏、胰腺和气道等上皮细胞[5]。研究发现耳蜗KCNQ1通道可能是参与耳蜗K+循环的重要通道蛋白[14,15],可将边缘细胞内的K+分泌至内淋巴,形成内淋巴高K+环境。在耳蜗中KCNQ1通道仅表达于血管纹边缘细胞的顶膜,是该膜的主要离子通道,因此可作为该细胞的独特标志物。若缺乏该通道将阻碍耳蜗血管纹转运钾离子进入内淋巴,进而影响神经递质的释放,最终造成听力损失[16]。本实验采用Ⅱ型胶原酶消化法成功建立了成年小鼠耳蜗血管纹MC的体外分离培养体系,有利于对成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞进行病理、生理和分子生物学等方面的深入研究。

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