赤芍总苷对人黑色素瘤细胞株凋亡诱导的作用机制

王亚珍 吕品田 王凤红 王辰英 (河北省人民医院保健处，河北 石家庄 05005)

赤芍为毛茛科植物芍药或川芍药的干燥根，其主要活性成分已证实为赤芍总苷(TPG)。其化学本质为单萜苷类化合物，具有抗血栓、抗凝作用，抗动脉粥样硬化、抗心肌或脑组织损伤作用等广泛药理作用〔1，2〕。近年研究证实TPG也具有抗肿瘤的作用〔3〕，但相关机制仍不清楚。黑色素瘤恶性程度高，复发转移迅速，迄今尚无有效治疗措施。本研究通过观察TPG对人黑色素瘤细胞株A375生长的影响及凋亡调节基因表达的检测，探讨TPG抗肿瘤的机制，为TPG防治黑色素瘤提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及药物 人黑色素瘤细胞株A375:购自中国科学院上海细胞研究所。赤芍总苷由河北医科大学药学院惠赠，纯度＞95%。

1.1.2 主要试剂 MTT，购自 Sigma公司;Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL及GAPDH一抗购自Santa Cruz公司;RT-PCR试剂盒购自大连宝生物技术公司;所用引物由上海生工生物技术公司合成，引物序列如下:Caspase-3上游引物5'-GGACAACAACGAAACCTCCG-3'，下游引物:5'-CTCCACTGGTATCTTCTGGCA-3'，扩增产物长度 568 bp;Bcl-2上游引物 5'-AGAGGGGCTACGAGTGGGAT-3'，下游引物5'-TCAAA GAAGGC CACAATCCTC-3'，扩增产物长度373 bp;Bax上游引物5'-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3'，下游引物 5'-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3'，扩增产物长度337 bp;Fas上游引物5'-TGGAGTTGAAGAGGAGCGT-3'，下游引物 5'-CATTTGGTGTTGCTGGTTCG-3'，扩增产物长度393 bp;FasL上游引物5'-ACCTCCATCACCACTACCA-3'，下游引物 5'-CAACTTCTTCTCCTCCATTAGC-3'，扩增产物长度531 bp;内参照β-actin上游引物5'-CAGGGTGTGATGGTGGG-3'，下游引物 5'-GGAAGAGGATGCGGCAG-3'，扩增产物长度500 bp。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定细胞抑制率 黑色素瘤A375细胞以含10%胎牛血清的RPMI 1640常规培养，取对数生长期的细胞制成细胞悬液，接种于 96 孔板，每孔 200 μl，加入 12.5、25、50、100、200 mg/L TPG，对照组加等量生理盐水，每组6个复孔。分别孵育24、48 h后进行MTT法，酶标仪测量各组细胞吸光度OD490值，计算生长抑制率(%)=(1－实验组OD值/对照组OD值)×100%。以上实验重复3次。

1.2.2 FCM测定细胞凋亡百分率 黑色素瘤细胞加入25 mg/L TPG作用48 h，对照组加等量生理盐水，收集细胞，Becton Dickinsor FACscan流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

1.2.3 RT-PCR 方法测定 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA的表达 黑色素瘤细胞细胞加入25 mg/L TPG孵育48 h，收集细胞，常规方法提取RNA，按RT-PCR试剂盒说明进行反转录反应和PCR扩增目的片段，PCR反应条件为95℃4 min，预变性后，95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，25 个循环后，72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行密度分析。以β-actin作为内参照。以目的基因/内参照密度值的比值进行比较。

1.2.4 Western 印迹法检测 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL 蛋白的表达 25 mg/L TPG孵育黑色素瘤细胞48 h，收集细胞，常规方法提取蛋白质，定量，SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，相应一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗三次后加相应二抗 HRP(辣根过氧化酶)-IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH作为内参照。用各蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件分析实验数据。计量资料采用t检验。

2 结果

2.1 TPG对黑色素瘤A375细胞抑制率的影响 TPG对A375细胞有抑制作用，随着TPG浓度增大和作用时间的延长，抑制率上升。见表1。

表1 TPG对黑色素瘤A375细胞抑制率的影响(n=6， ± s，%)

表1 TPG对黑色素瘤A375细胞抑制率的影响(n=6， ± s，%)

剂量(mg/L) 24 h抑制率 48 h抑制率12.5 4.61±0.69 8.52±0.79 25 14.33±2.61 19.53±2.66 50 39.27±3.23 31.09±4.05 100 59.11±3.26 70.96±4.96 200 66.82±5.95 83.67±6.74

2.2 TPG对黑色素瘤细胞凋亡率的影响 与对照组比，25 mg/L TPG处理黑色素瘤细胞48 h后，细胞凋亡率明显上升(P＜0.01)。见表2。

2.3 TPG 对黑色素瘤细胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表达的影响 与对照组比，TPG处理组Caspase-3、Bax、Fas、FasL mRNA表达水平均显著升高(P＜0.01)，Bcl-2 mRNA表达水平显著下降(P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值明显降低(P＜0.01)。见表2，图1。

2.4 TPG 对黑色素瘤细胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL 蛋白表达的影响 与对照组比，TPG处理组 Caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表达均显著升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表达显著下降(P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.01)，与mRNA表达变化一致。见表3，图2。

表2 TPG对黑色素瘤细胞的细胞凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表达的影响(± s，n=6)

表2 TPG对黑色素瘤细胞的细胞凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表达的影响(± s，n=6)

与对照组比较:1)P＜0.01，下表同

指标 细胞凋亡率(%) Caspase-3 mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA Bcl-2/Bax F as mRNA FasL mRNA对照组 3.92±0.58 0.46±0.06 0.61±0.08 1.51±0.19 2.46±0.28 0.67±0.08 0.55±0.07赤芍总苷组 10.48±2.051) 0.90±0.111) 1.32±0.151) 0.53±0.071) 0.40±0.051) 1.34±0.161) 1.33±0.211)

表3 TPG对黑色素瘤细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL蛋白表达的影响( ± s，n=6)

表3 TPG对黑色素瘤细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL蛋白表达的影响( ± s，n=6)

指标Caspase-3 Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax Fas FasL对照组 0.41±0.05 0.33±0.04 0.94±0.12 2.81±0.19 0.35±0.05 0.39±0.05赤芍总苷组 0.73±0.081) 0.98±0.111) 0.29±0.041) 0.30±0.051) 0.97±0.141) 0.86±0.091)

图1 TPG 对 A375细胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表达的影响

图2 TPG对A375细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL 蛋白表达的影响

3 讨论

黑色素瘤恶性程度高、转移迅速，迄今尚无有效的治疗手段。手术很难达到对黑色素瘤的根治目的，而该病对于放化疗也均不敏感。因此，寻找新的药物对黑色素瘤进行治疗意义重大。近年来赤芍总苷已在多种疾病治疗的研究中取得了良好效果〔1～3〕，其机制主要在于该药可诱导多种肿瘤细胞凋亡而发挥作用。但该药是否能对黑色素瘤细胞的凋亡情况发生影响尚未见报道。本研究显示，TPG对A375细胞有明显抑制作用，且随着TPG浓度增大和作用时间的延长，药物对肿瘤细胞的抑制率随之上升，当浓度达到200 mg/L时抑制率可达到80%以上。进一步研究发现25 mg/L TPG作用黑色素瘤细胞48 h，TPG处理组Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均显著升高，而Caspase-3是凋亡的关键因子之一，可直接参与凋亡的早期启动、凋亡信号的传递及凋亡晚期事件的发生〔4，5〕，表明TPG可通过增加Caspase-3的表达，诱导细胞凋亡。

细胞凋亡过程受一系列相关基因调控，除Caspase-3外，Bcl-2家族通过线粒体途径影响细胞凋亡，也是目前关注的热点。根据其功能，Bcl-2家族可分为促生存和促凋亡两类。Bcl-2是迄今为止功能最明确的细胞凋亡拮抗基因〔6〕。原癌基因Bax同属Bcl-2基因家族，当Bcl-2过量时，形成Bcl-2/Bax同源二聚体，细胞凋亡受到抑制;反之当Bax过量时，细胞则趋向凋亡，本研究可见，TPG组Bax表达水平升高、Bcl-2水平下降，Bcl-2/Bax比值显著降低，提示TPG可通过调节Bcl-2/Bax比值诱导黑色素瘤细胞凋亡。

Fas/FasL系统则是介导细胞凋亡的重要信号转导通路，Fas基因编码Ⅰ型膜受体蛋白，FasL是Ⅱ型膜蛋白，同属肿瘤坏死因子受体家族，当一个细胞的FasL与另一个细胞的Fas结合时，可以导致表达Fas的细胞凋亡。正常情况下Fas和FasL并不介导细胞凋亡，只有在Fas/FasL系统过度表达时才介导细胞凋亡，造成组织和器官的损伤〔7〕。本研究观察到TPG作用黑色素瘤细胞后，Fas、FasL蛋白表达水平均显著升高。我们的结果提示TPG可通过上调Fas/FasL表达促进细胞凋亡。

综上所述，TPG可通过上调黑色素瘤细胞Caspase-3、Fas和FasL表达，降低Bcl-2/Bax比值，诱导细胞凋亡，发挥抗癌作用。但本研究仅在细胞水平对该药促进黑色素瘤细胞凋亡的机制进行了研究，今后还要进一步进行实验动物研究及临床应用，对该药治疗黑色素瘤的效果进行深入探讨。

1 高雪岩，孙建宁，王文全，等.赤芍总苷的制备及其对小鼠肝损伤的保护作用〔J〕.中国实验方剂学杂志，2010;16(18):183-6.

2 葛文龙，窦志华，罗 琳，等.赤芍总苷对α-萘异硫氰酸酯诱导的小鼠胆汁淤积型肝损伤的保护作用〔J〕.时珍国医国药，2010;21(11):2881-2.

3 许惠玉，陈志伟，周 丽，等.赤芍总苷非受体依赖途径诱导K562肿瘤细胞凋亡及相关基因变化的实验研究〔J〕.中国中药杂志，2010;35(24):3377-81.

4 Ristorcelli E，Lombardo D.Targeting Notch signaling in pancreatic cancer〔J〕.Expert Opin Ther Targets，2010;14(5):541-52.

5 D'Amelio M，Cavallucci V，Cecconi F.Neuronal caspase-3 signaling:not only cell death〔J〕.Cell Death Differ，2010;17(7):1104-4.

6 Rohrbach S，Muller-Werdan U，Werdan K，et al.Apoptosis-modulating interaction of the neuregulin/erbB pathway with anthracyclines in regulating Bcl-xS and Bcl-xL in cardiomyocytes〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2005;38:485-93.

7 Baldini E，Ulisse S，Marchioni E，et al.Expression of Fas and Fas ligand in human testicular germ cell tumours〔J〕.Int J Androl，2009;32(2):123-30.