皮质下血管性认知功能障碍患者血清sCD40L水平的变化

董艳红 李 玲 王秀玲 吕佩源 范鸣玥 许 静 孟 楠

(河北医科大学研究生院，河北 石家庄 050017)

皮质下缺血性脑血管病(subcortical ischemic vascular disease，SIVD)的发病机制复杂，其中免疫和炎症机制参与了慢性脑缺血所致痴呆的过程，中枢神经系统可以对缺血、神经变性疾病等产生完整的炎症反应。研究提示，CD40-CD40L是各种免疫与炎症调节的重要的信号转导系统。本课题首次通过检测SIVD患者血清中可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand，sCD40L)的水平，了解其变化规律，进一步从临床角度探讨其与白质病变(WML)、认知障碍的相关性，以期能为SIVD寻求更多、更有效的多方位诊断和治疗手段提供线索。

1 对象与方法

1.1 对象 SIVD患者来自2009年9月至2010年12月间我院神经内科门诊和住院患者，依据Erkinjuntti〔1〕提出MRI诊断标准和血管性认知功能损害的专家共识〔2〕确定SIVD。正常对照组受试者来自年龄和性别匹配的认知功能正常的老年体检人群。所有受试者均由2位副主任医师以上神经内科医师根据病史、症状、神经系统检查、常规实验室检查及头颅MRI平扫等做出诊断。共入选SIVD患者39例，按照认知损害的诊断标准分为血管性痴呆(VD)组和血管性认知障碍非痴呆(vascular cognitive impairment no dementia，VCIND)组。①VD组。参照美国国立神经疾患和脑卒中研究所和瑞士神经科学研究国际协会(NINDS-AIREN)VD 的标准〔3〕和 Wentzel〔4〕提出的 VCI诊断标准，结合张明园等〔5〕提出简明精神状态检查(MMSE)痴呆筛选分界值。具体如下:(1)有认知功能减退的主诉或有知情人提供的认知功能减退;(2)MMSE评分文盲≤17分，小学≤20分，初中及以上≤24分;(3)认知功能量表检查至少有一个认知领域损伤的客观证据;(4)日常生活能力量表(ADL)评分＞26分;(5)CDR评分≥0.5分。VD患者19例，其中男15例、女4例。②VCIND组。VCIND患者20例，男16例、女4例。纳入标准〔6〕:(1)患者有轻度认知损害，有知情者证实;(2)一般认知功能保留，日常生活能力未受损，ADL评分＜26分，各项认知功能评分低于对照组1.5个标准差;(3)未达到美国精神障碍诊断和统计手册第四版(DSM-Ⅳ)的痴呆诊断标准，CDR评分为0.5分;(4)认知障碍由脑血管病导致。③正常对照(NC)组。正常对照15例，其中男11例，女4例，年龄60～85〔平均(70.67±6.90)〕岁，MMSE评分为(28.13±1.06)分。

1.2 排除标准 (1)排除皮质和(或)皮质-皮质下非腔隙性梗死和分水岭梗死、出血、正常颅压脑积水和其他原因造成的WML(如多发性硬化、结节病、放射性脑病等);(2)排除其他原因所致认知损害，如正压性脑积水、甲状腺功能障碍、维生素缺乏等;(3)24项Hamilton抑郁量表≥8分;或Hachinski缺血量表评分≤6分;或临床痴呆分级量表＞2分者;(4)排除失语、偏瘫、耳聋等无法完成神经心理学评估者;(5)排除有脑发育障碍、精神发育迟滞、近期脑外伤、癫痫、药物滥用及中枢神经系统感染性疾病史等;(6)排除存在下列情况之一者:有严重的心、肝、肺、肾等脏器功能不全，急、慢性感染(包括2 w内有明确感染史，慢性肝炎急性期或活动期)，自身免疫性疾病，应用免疫抑制剂史。

1.3 方法

1.3.1 神经心理学评估 由经过专门的神经心理学检测培训的专职医师、应用标准化语言对每位受试者和家属进行详细的神经心理测试和临床访谈，测查MMSE、蒙特利尔认知评估量表北京版(MoCA)。检查结束后，两名评定者分别独立评分，取平均值。

1.3.2 头MRI扫描 采用美国GE公司生产的3.0T磁共振成像仪(GE SIGNA EXCITEⅡ)对入选患者行头MRI扫描，常规轴位T1加权成像(T1WI)，T2加权成像(T2WI)，液体衰减反转回复序列(T2-FLAIR)检查。

1.3.3 脑WML分级评分 采用Wahlund〔7〕等提出的年龄相关WML评分方法，将大脑左右半球分别分为额区、顶枕区、颞区、幕下区和基底节共10个区域，根据WML程度不同，每个区域按照0～3分的四级标准分别给出评分，总分0～30分。由两名副主任医师分别单独评分，取其均值作为WML最终评分。见图1。

1.3.4 sCD40L浓度检测

1.3.4.1 主要仪器 酶标仪:Biotek ELX800型酶标仪;离心机:低速台式自动平衡离心机，型号DT5-6(北京时代北利离心机有限公司)。

1.3.4.2 主要试剂 sCD40L检测试剂盒:human sCD40L BMS239，由奥地利Bender MedSystemS公司提供，其检测灵敏度为0.062 ng/ml。

1.3.4.3 标本收集 所有受试者过夜禁食12 h后，于次晨空腹肘静脉采取非抗凝血3～4 ml，自然凝固30 min后常温3 000 r/min离心10 min，分离血清，－70℃低温冰箱保存，等待成批酶联免疫吸附法(ELISA)检测。

1.3.4.4 sCD40L浓度检测 应用ELISA法测定血清sCD40L浓度，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件，当定量资料满足正态分布及方差齐时，用方差分析对3组年龄、受教育水平、认知评分及sCD40L浓度进行比较，当不满足正态分布及方差齐时应用多个样本秩和检验;性别构成应用多个样本率比较的χ2检验;采用Spearman相关分析统计sCD40L浓度与MoCA评分的相关性。所有数据用±s表示。

2 结果

2.1 认知测评及sCD40L浓度检测 SIVD两组与NC组相比，WML评分和血清sCD40L浓度增高(P＜0.05)。VD组与VCIND组之间比较差异不显著(P＞0.05)。三组受试者MMSE、MoCA评分比较差别显著(P＜0.05)。见表1。

表1 三组认知功能、WML评分及sCD40L的比较(x±s)

图1 WML示例图

2.2 sCD40L浓度与神经心理评分、白质病变评分的相关分析 sCD40L 浓度与 MMSE(r=0.210，P=0.213)、MoCA(r=0.322，P=0.055)、WML(r=0.003，P=0.988)评分均无明显相关性。

3 讨论

近年来发现的重要炎症标志物CD40/CD40L(CD40配体)是一对互补的跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族成员，为T、B细胞活化提供必需的第二信号，广泛参与了细胞免疫、体液免疫和炎症反应的调节〔8〕，是免疫应答的中心环节。sCD40L由CD40L水解而成，主要由活化血小板释放入血，可进一步激活血小板，促进炎症反应和血栓形成〔9〕。健康人血清中sCD40L低表达，当机体出现慢性炎症反应后，sCD40L水平明显增加。国外研究发现，VD、阿尔茨海默病(AD)的神经病理学改变均与CD40异常高表达相关的小胶质细胞活化有着密切的关联〔10〕。Deng等〔11〕证实，激活的小胶质细胞可以通过有丝分裂原激活蛋白途径产生炎性细胞因子，对少突胶质细胞产生损害作用，导致脑室周围WML。有学者提出血浆sCD40是AD细胞分化的生物学标志〔12〕，目前国内尚无对于CD40与VD认知损害的研究。

本研究结果提示CD40/CD40L信号通路参与了SIVD的发生，SIVD的发病机制中存在着慢性炎性因素。究其原因，二者之间的临床相关性与动脉粥样硬化有着密不可分的联系。动脉粥样硬化可导致腔隙梗死、深穿支小动脉狭窄，造成SIVD的认知损害〔13〕。CD40/CD40L作为免疫及炎症反应中重要的信号转导系统，其相互作用可造成内皮细胞损伤，诱导内皮细胞和血管平滑肌细胞等表达一些前炎症因子，促进细胞因子的合成，上调细胞表面黏附因子表达，诱导趋化因子的生成，刺激基质金属蛋白酶合成和释放，引发慢性炎症反应，因此在动脉粥样硬化的发病机制中起着极为关键的作用〔14，15〕。在SIVD的发病机制中，脑微循环变化有着重要意义〔16〕，内皮细胞功能下降影响脑微循环，造成低灌注、慢性脑缺血，有可能加重VD进展。动物实验在脑内微循环的内皮细胞也发现了CD40的组成性表达〔17〕。因此sCD40L在SIVD发展中的作用值得引起重视，下调CD40/CD40L的相互作用有可能延缓SIVD的发生。

有研究表明，慢性脑缺血时，由于能量代谢障碍，引起损伤级联反应，炎性因子如sCD40L等可使小胶质细胞活化。激活的小胶质细胞能够分泌大量的炎性介质加重炎性反应，导致恶性循环，最终促进神经元损伤、髓鞘脱失，造成脑白质损伤，加之神经元的毒性作用，从而导致认知障碍。但本研究中并未发现血清sCD40L水平与WML明显相关，而且VD、VCIND两组之间的差异并无统计学意义。进一步对两组患者的sCD40L与MMSE、MoCA的相关分析也显示SCD40L与总体认知功能评分均无相关性，表明尽管sCD40L可能参与了SIVD的病理变化过程，但由于血脑屏障等因素，中枢神经系统的免疫功能失调不一定在外周表现出来，外周血清中sCD40L水平并不能完全代表大脑的炎性反应状况，也无法反映SIVD患者认知障碍的程度变化。sCD40L浓度的升高也可能与动脉粥样硬化、危险因素、并发疾病等有一定关系，其相关性有待进一步证实。

1 Erkinjuntti T，Inzitari D，Panton I，et al.Limitations of clinical criteria for the diagnosis of vascular dementia in clinical trials.Is a focus on subcortical vascular dementia a solution〔J〕?Ann NY Acad Sci，2000;903:262-72.

2 血管性认识功能损害专家共识组.血管性认识功能损害的专家共识〔J〕.中华内科杂志，2007;46:1052-5.

3 Roman GC，Tetemichi TK，Erkinjuntti T，et al.Vascular dementia:diagnostic criteria for research studies.Report of the NINDS-AIREN International Workshop〔J〕.Neurology，1993;43(2):250-60.

4 Wentzel C，Darvesh S，Macknight C，et al.Inter-rater reliability of the diagnosis of vascular cognitive impairment at a memory clinic〔J〕.Neuroepidemiology，2000;19(4):186-93.

5 张明园，瞿光业，金 华，等.几种痴呆测试工具的比较〔J〕.中华神经精神科杂志，1991;24(2):194-6.

6 Roman GC，Sachdev P，Royall DR，et al.Vascular cognitive disorder:a new diagnostic category updating vascular cognitive impairment and vascular dementia〔J〕.J Neurol Sci，2004;226(1-2):81-7.

7 Wahlund LO，Barkhof F，Fazekas F，et al.A new rating scale for age-related white matter changes applicable to MRI and CT〔J〕.Stroke，2001;32(6):1318-22.

8 Schonbeck U，Libby P.The CD40/CD40L receptor/ligand dyad〔J〕.Cell Mol Life Sci，2001;58(1):4-43.

9 Andre P，Prasad KS，Denis CV，et al.CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta 3 integrin-dependent mechansm〔J〕.Nat Med，2002;8(3):247-52.

10 Giunta B，Figueroa KP，Town T，et al.Soluble CD40 ligand in dementia〔J〕.Drugs Future，2009;34(4):333-40.

11 Deng Y，Lu J，Sivakumar V，et al.Amoeboid microglia in the periventricular white matter induce oligodendrocyte damage through expression of proinflammatory cytokines via MAP kinase signaling pathway in hypoxic neonatal rats〔J〕.Brain Pathol，2008;18(3):387-400.

12 Chui HC.Subcortical ischemic vascular dementia〔J〕.Neurol Clin，2007;25(3):717-40.

13 Mocali A，Cedrola S，Della Malva N，et al.Increased plasma levels of soluble CD40，together with the decrease of TGF beta1，as possible differential markers of Alzheimer disease〔J〕.Exp Gerontol，2004;39(10):1555-61.

14 Shibuya H，Nagai T，Ishii A，et al.Differential regulation of Th1 responses and CD154 expression in human CD4+T cells by IFN-alpha〔J〕.Clin Exp Immunol，2003;132(2):216-24.

15 Reinders ME，Sho M，Robertson SW，et al.Proangiogenic function of CD40 ligand-CD40 interactions〔J〕.J Immunol，2003;171(3):1534-41.

16 Kuwabara Y，Ichiya Y，Sasaki M，et al.Time dependency of the acetazolamide effect on cerebral hemodynamics in patients with chronic occlusive cerebral arteries:early steal phenomenon demonstrated by15O-H2O positron emission tomography〔J〕.Stroke，1995;26(10):1825-9.

17 Ishikawa M，Vowinkel T，Karen Y，et al.CD40/CD40 ligand signaling in mouse cerebral microvasculature after focal ischemia/reperfusion〔J〕.Circulation，2005;111(13):1690-6.