槟榔碱对STZ致INS-1细胞损伤的保护和修复作用

李中平 任文辉 张保丽 蔺美玲 陈红梅 赵 丽 王志强 张小郁

(兰州大学基础医学院生理学与心理学研究所，甘肃 兰州 730000)

目前，许多人工合成的降血糖药物都很昂贵且长期服用有许多副作用，而从天然植物中提取出来的抗糖尿病药物具有低毒性、低副作用等优点。槟榔碱是槟榔种子中所含生物碱的主要成分，有研究表明槟榔有抗炎、抗过敏作用，低剂量槟榔碱能够改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱〔1～3〕。但是槟榔碱对INS-1胰岛细胞的有关研究尚少。因此，本文体外建立链脲佐菌素(STZ)致胰岛细胞损伤模型，研究槟榔碱对STZ损伤胰岛细胞的保护和修复作用及其机制，为槟榔碱治疗糖尿病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)，购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 试剂 槟榔碱(Arecoline)，纯度＞98%，为陕西旭煌植物科技发展有限公司生产。RPMI 1640、胰蛋白酶均购自Gibco公司。STZ、十二烷基硫酸钠(SDS)、噻唑蓝(MTT)均购自Sigma公司。新生牛血清为杭州四季青公司产品。总抗氧化能力(TAOC)和丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，用UV-VIS 756MC分光光度计检测。胰岛素由兰州市中国人民解放军第一医院检验科测定。

1.3 仪器 微孔板分光光度计(Power Wave X BIO-TEX INSTRUMENTS.INC)，GC-1200 γ 放射免疫计数仪(合肥)，倒置显微镜(OLYMPUS CKX41)，EPPENDORF 5810R型台式冷冻离心机(德国艾本德股份公司)，CO2孵箱(inCu safe copper ALLOY STAINLESS)，SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化厂)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 用含10%新生牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1 mmol/L 丙酮酸钠，50 μmoL/L β-巯基乙醇，5.6 mmol/L 葡萄糖，1×105IU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基，在37℃，5%CO2及饱和湿度的恒温箱中培养，每2～3 d传代一次。

1.4.2 槟榔碱对INS-1细胞胰岛素释放的影响 将密度为1×105/ml的INS-1细胞悬液接种至96孔培养板，随机分为正常对照组、槟榔碱组(1 ×10－5mol/L、1 ×10－6mol/L、1×10－7mol/L)，每组6个复孔，培养箱中培养24 h后，将上述各组药物加入各孔，12 h后收集细胞上清，放射免疫法检测胰岛素的释放量。

1.4.3 槟榔碱对INS-1细胞增殖活力的影响 如1.4.2方法制备细胞悬液并分组，并设空白调零孔。培养箱中培养24 h后，各孔分别加5 mg/ml MTT，继续培养4 h后加10%SDS于37℃放置过夜后，用酶标仪测定OD570nm值。

1.4.4 槟榔碱对STZ所致INS-1细胞损伤的保护和修复作用

如1.4.2方法制备细胞悬液，随机分为正常对照组、STZ 3 mmol/L组、保护组(槟榔碱1×10－5mol/L+STZ、槟榔碱1×10－6mol/L+STZ、槟榔碱 1 × 10－7mol/L+STZ)与修复组(STZ+槟榔碱 1×10-5mol/L、STZ+槟榔碱 1×10－6mol/L、STZ+槟榔碱1×10－7mol/L)，每组6个复孔，并设空白调零孔。培养箱中培养24 h后，保护组将上述药物加入各孔，继续培养12 h;修复组先加3 mmol/L STZ作用6 h再加槟榔碱作用6 h，随后收集细胞上清，用放射免疫法测其胰岛素的释放量，同时用MTT法测其各孔的OD值。

1.4.5 槟榔碱对INS-1细胞生成MDA和T-AOC能力的影响

如上述方法制备细胞悬液，随机分为正常对照组、STZ组、保护组(槟榔碱1×10－6mol/L+STZ)与修复组(STZ+槟榔碱1×10－6mol/L)，每组6个复孔。收集细胞上清，按照试剂盒说明书采用TBA法测定MDA的含量，比色法测定T-AOC的含量。

1.5 统计学分析 采用SPSS16.0软件进行统计分析，各项指标均以±s表示。

2 结果

2.1 槟榔碱对INS-1细胞增殖活力和胰岛素释放的影响 与正常对照组比较，槟榔碱显著促进了INS-1细胞的增殖活力和胰岛素释放量，但其浓度效应关系不明显。见表1。

表1 槟榔碱对INS-1细胞增殖活力和胰岛素释放的影响(± s，n=6)

表1 槟榔碱对INS-1细胞增殖活力和胰岛素释放的影响(± s，n=6)

与正常对照组比较:1)P＜0.01

组别 OD值 胰岛素释放量(μIU/L正常对照组)0.347±0.015 1.17±0.09槟榔碱组(1×10－5mol/L) 0.439±0.0181) 2.95±0.351)(1×10－6mol/L) 0.400±0.0121) 3.29±0.411)(1×10－7mol/L) 0.389±0.0181) 3.10±0.531)

2.2 槟榔碱对STZ致INS-1细胞损伤的保护和修复作用 与正常对照组比较，STZ组胰岛素释放量及OD值明显降低;与STZ组比较，保护组和修复组的OD值和胰岛素释放量显著升高，说明槟榔碱对STZ所致INS-1细胞损伤有一定的保护和修复作用。见表2。

2.3 槟榔碱对INS-1细胞MDA生成和T-AOC能力的影响

与正常对照组比较，STZ组MDA含量显著升高，而T-AOC显著降低;与STZ组比较，槟榔碱保护组和修复组MDA含量均显著降低，而T-AOC含量均显著升高，说明STZ致INS-1细胞损伤可能是通过提高MDA的生成量和降低细胞T-AOC来实现的。见表3。

表2 槟榔碱对STZ致INS-1细胞损伤的保护和修复作用( ± s，n=6)

表2 槟榔碱对STZ致INS-1细胞损伤的保护和修复作用( ± s，n=6)

与正常对照组比较:1)P＜0.01;与STZ组比较:2)P＜0.01;下表同

组别 OD值 胰岛素释放量(μIU/L)正常对照组0.256±0.021 7.940±0.459 STZ组(3 mmol/L) 0.146±0.0211) 1.198±0.4271)保护组(1×10－5mol/L+STZ) 0.186±0.0141)2) 6.033±0.8631)2)(1×10－6mol/L+STZ) 0.185±0.0131)2) 7.302±0.4962)(1×10－7mol/L+STZ) 0.165±0.0131) 4.388±1.0681)2)修复组(STZ+1×10－5mol/L) 0.258±0.0262) 9.074±1.0871)2)(STZ+1×10－6mol/L) 0.222±0.0512) 5.210±0.4431)2)(STZ+1×10－7mol/L) 0.205±0.0321) 3.717±0.7861)2)

表3 槟榔碱对INS-1细胞MDA生成和T-AOC能力的影响(± s，n=6)

表3 槟榔碱对INS-1细胞MDA生成和T-AOC能力的影响(± s，n=6)

组别 MDA(nmol/ml) T-AOC(kU/L)正常对照组3.16±0.39 2.43±0.27 STZ组 10.23±0.601) 1.30±0.221)保护组 4.05±0.622) 2.01±0.271)2)修复组 3.62±0.562) 2.17±0.242)

3 讨论

氧化应激是机体在遭受有害刺激后，产生了过量的活性氧簇(ROS)〔4，5〕，超出了系统对其的消除能力，过剩的 ROS 对细胞的DNA、蛋白质、脂质等造成巨大的损伤，同时也影响细胞信号转导，导致胰岛素基因表达障碍，从而降低胰岛素分泌量，导致糖尿病〔6，7〕。STZ可以直接产生ROS，被广泛的用来制作糖尿病模型。由于胰岛β细胞与机体其他细胞相比，细胞内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化水平较低。因此，也更容易受到ROS的损伤。ROS包括活性氧自由基及在细胞内外环境能产生自由基的各种物质，如超氧阴离子、过氧化脂质、过氧化氢以及羟自由基等。ROS可以攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，并因此形成脂质过氧化物，其代谢产物MDA是一种有害物质，可作为评价脂质过氧化反应强弱的指标〔7〕。从实验中可以看到，STZ组显著降低了胰岛素的释放，提高了MDA的生成，并降低了T-AOC能力。与STZ组比较，保护组和修复组胰岛素释放量均显著升高，MDA含量显著降低，而T-AOC显著升高。说明槟榔碱对STZ致INS-1细胞损伤的保护和修复作用可能是通过抑制脂质过氧化产物生成，提高细胞的总抗氧化能力实现的。

另外，与正常对照组比较，高、中、低三个剂量的槟榔碱均显著促进INS-1细胞的增殖活力和胰岛素释放，但是究竟槟榔碱是通过何种机制来完成这种功能还有待进一步的研究。

综上所述，本实验表明槟榔碱明显促进了INS-1细胞的增殖活力和胰岛素释放，且对STZ损伤的INS-1细胞具有一定的保护和修复作用，为槟榔碱治疗糖尿病提供了一定的理论依据，而槟榔碱对STZ致INS-1细胞损伤的保护和修复作用以及槟榔碱对INS-1细胞增殖活力和胰岛素释放的影响机制仍需进一步的深入研究。

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7 Kaneto H，Nakatani Y，Kawamori D，et al.Role of oxidative stress，endoplasmic reticulum sress，and c-Jun N-terminal kinase in pancreatic betacell dysfunction and insulin resisitance〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2006;38(5-6):782-93.