趋化因子Fractalkine在大鼠重症急性胰腺炎中的作用及乌司他丁的干预效应*

2011-08-02许可银周国雄朱郁飞

中国病理生理杂志 2011年11期

张弘，许可银，周国雄，朱郁飞，魏群，李峰

(1南通大学附属医院消化内科，江苏南通 226001;2盐城市城南医院消化内科，江苏盐城 224001)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一种严重的全身性疾病，病情凶险，死亡率高［1］，其严重程度及多器官功能障碍与多种细胞因子级联反应密切相关，但趋化因子在其中起了何种作用尚不十分清楚。趋化因子是一类能趋化细胞定向移动的小分子分泌蛋白，其主要作用为趋化和激活白细胞，参与炎症反应，其氨基酸组成具有特异的半胱氨酸，根据半胱氨酸的排列位置不同可分为 C、CC、CXC和CX3C 4类共50余种。目前认为，fractalkine(FKN)是CX3C族中的唯一成员，主要表达于人体活化的内皮细胞表面，同时也可以可溶性形式存在，在炎症局部发挥其诱导细胞聚集和维持稳态等作用［2，3］。本实验通过建立大鼠重症急性胰腺炎模型，并采用乌司他丁(ulinastatin，UT)进行干预，ELISA法检测不同时点血清中FKN水平;采用实时荧光定量PCR法检测FKN mRNA在SAP模型的胰腺组织和肺组织中的表达变化情况，及其与病理组织学改变的关系，探讨FKN在SAP发病过程中的作用，为临床工作中急性胰腺炎治疗方案的进一步完善提供新的实验基础和理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物健康雄性SD大鼠72只，清洁级，体重(200±30)g，由南通大学实验动物中心提供，随机分成3组:SAP组、乌司他丁治疗组(SAP+ulinastatin treatment，SAP+UT)和生理盐水对照组(control)，每组24只。

1.2 主要试剂淀粉酶测定试剂盒(四川迈克科技有限公司);大鼠FKN ELISA试剂盒(上海西唐生物公司);Total RNA提取试剂、逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒［宝生物工程(大连)有限公司］;自行设计FKN和GAPDH引物，由上海博彩生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 动物模型大鼠术前禁食12 h，禁水6 h，用2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔内注射麻醉，正中切口进腹，胆胰管十二指肠开口处予无损伤金属夹夹闭，注射器针头向十二指肠开口方向插入胆胰管，SAP组以0.1 mL/min的速度向胆胰管内注射4%牛磺胆酸钠，剂量为1 mL/kg，5 min后拔除注射针，松开金属夹，缝合关腹;UT在造模成功后立即在大腿皮下注射UT(3×104U/kg)进行干预治疗;对照组向胆胰管注射与牛磺胆酸钠组等量的无菌生理盐水。每组再随机分成4个亚组，每个亚组6只大鼠。分别于术后1、3、6、12 h予以处死，心脏取血，置37℃30 min后离心收集血清于4℃保存，用于淀粉酶和ELISA检测;留取胰腺和肺组织，一份－80℃贮存用于实时荧光定量PCR;一份放入4%甲醛，用于病理学检测。

2.2 血清淀粉酶(amylase，AMS)测定采用碘－淀粉比色法，操作严格按照试剂说明书进行，由美国Vitros－250型全自动生化分析仪测定。

2.3 血清FKN ELISA检测取出酶标板，设空白孔，依次加入标准品及样本血清各100 μL于包被好抗大鼠FKN单抗的各孔中，37℃孵育2 h，然后严格按照试剂盒说明书要求进行洗板操作，分别加入生物素化的Ⅰ抗、辣根过氧化酶标记的链霉亲和素及底物甲基联苯胺溶液，经终止液作用后30 min内用Therm。MK3型酶标仪在450nm处测吸光度值(A值)。

2.4 实时荧光定量PCR检测取－80℃冷冻保存的组织50－100 mg用RNAiso Plus试剂，严格按操作手册提取胰腺和肺组织总RNA，采用紫外分光光度法定量RNA。用PrimeScriptTMRT试剂盒合成cDNA，逆转录体系包括1 μL总 NRA;2 μL 5×逆转录buffer;0.5 μL oligo dT;0.5 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I，加 DEPC 水至总体积 10 μL，反应条件如下:37℃ 15 min;85℃ 5 s。自行设计大鼠GAPDH及CX3CL1引物各一对，FKN上游引物5'－TGCCACAAGATGACCTCGCCA －3'，下游引物 5'－TCCAGGTGCTTCATGGCGTCT－3'，扩增产物片段大小为164 bp;GAPDH上游引物 5'－AAGGTGGTGAAGCAGGCGGC －3’，下游引物5'－GAGCAATGCCAGCCCCAGCA－3’，扩增产物片段大小为130 bp。取2 μL cDNA模板进行 RT－qPCR，加入 SYBR premix Ex Taq 12.5 μL，引物各 0.5 μL，再加入灭菌蒸馏水使反应体积为25 μL。PCR反应采用两步法，条件为:预变性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，然后进入熔解曲线测定程序。最后计算ΔCt值和RQ值。

2.5 组织病理学检查所有大鼠处死后均做病理检查，所取的胰腺组织和肺组织标本常规脱水、石蜡包埋，5 μ厚切片，行HE染色，进行组织病理学观察。胰腺组织和肺组织病理学评分及分级，均由2位专业的病理医师双盲阅片，每组随机取3张切片，每张切片随机选取10个高倍镜视野，以水肿、感染、出血和坏死评价胰腺组织损伤的程度。胰腺组织具体参考Rongione等［4］的评分标准，进行病理评分，各项最低分为0分，最高分为4分，取各项积分总和为最终得分。肺组织病理学评级具体参考雷文章等［5］的评级标准进行评级，最低级为0级，最高级为Ⅲ级。

3 统计学处理

结果

1 血清淀粉酶活性的变化

SAP 和UT 组1 h、3 h、6 h、12 h 各亚组血清淀粉酶活性与对照组比较均明显升高，差异显著(P＜0.01);UT组与SAP组相比较，1 h和3 h两亚组间没有显著差异(P＞0.05);而6 h和12 h，UT组血清淀粉酶活性升高程度比SAP组显著减低(P＜0.01)，见表1。

表1 各组不同时点血清淀粉酶活性的变化Table 1.Changes of serum amylase activity in each group at various time points(U/L..n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs SAP group.

Control 725±129 1646±144 2004±107 2168±140 SAP 2441±218＊＊ 3552±283＊＊ 6576±265＊＊ 7666±409＊＊SAP+UT 2176±220＊＊ 3260±182＊＊ 4672±236＊＊##4952±208＊＊##

2 血清FKN浓度的变化

SAP组血清FKN水平随时间变化逐渐升高，在1 h时点，3组间血清FKN水平变化无显著差异(P＞0.05);SAP组在3h、6h和12h血清FKN水平高于对照组，差异显著(P＜0.05)，而UT组与对照组之间血清FKN水平差异无显著(P＞0.05)，SAP组与UT组血清FKN水平在6 h和12 h时，显著差异，见表2。

表2 各组不同时点血清FKN浓度的变化Table 2.Changes of serum FKN level in each group at various time points(ng/L..n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 115.6 ±6.5 140.1±5.3 147.8±5.7 168.4±5.9 SAP 121.7 ±5.1 172.4±8.7* 188.6±11.9* 240.8 ±10.1*SAP+UT 118.1 ±9.3 150.2±5.6 153.2±4.6# 175.1 ±10.3#

3 胰腺组织FKN mRNA的表达

SAP组胰腺组织FKN mRNA的表达随时间变化逐渐升高，SAP组1h与对照组相比无显著差异，3 h表达高于对照组(P＜0.05)，6和12 h表达显著高于对照组(P＜0.01);UT组各时点与对照组相比均无显著差异，UT组3 h、6 h和12 h时点胰腺组织FKN mRNA表达均低于SAP组，见表3。

表3 各组不同时点胰腺组织中FKN mRNA表达的变化Table 3.Changes of FKN mRNA expression in pancreas in each group at various time points(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 0.15±0.02 0.25±0.04 0.38±0.04 0.49±0.04 SAP 0.15±0.01 0.32±0.02* 0.50±0.05＊＊ 0.78±0.04＊＊SAP+UT 0.16±0.10 0.25±0.03# 0.40±0.03# 0.59±0.05#

4 肺组织FKN mRNA的表达

SAP组肺组织FKN mRNA的表达随时间变化逐渐升高，SAP组1 h与对照组相比无显著差异，3 h、6 h和12 h表达显著高于对照组(P＜0.01);UT组3 h、6 h和12 h时点肺组织FKN mRNA的表达均低于SAP组的表达;UT组与对照组相比较，各时点无显著差异，见表4。

表4 各组不同时点肺组织FKN mRNA表达的变化Table 4.Changes of FKN mRNA expression in lung in each group at various time points(.n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h 0.06 SAP 0.13±0.03 0.34±0.06* 0.46 ±0.07* 0.68±0.06*SAP+UT 0.12±0.02 0.23±0.03# 0.39±0.05# 0.46±0.05 Control 0.11±0.02 0.19±0.04 0.28 ±0.05 0.38±#

5 胰腺组织病理学改变及评分

对照组大鼠胰腺光镜下细胞结构清楚、完整，小叶界限明确，间质无水肿，但是有少量炎症细胞浸润，偶见点状出血，极少量腺泡细胞坏死。

SAP组术后1 h、3 h可见明显小叶间水肿，片状出血，炎症细胞浸润，部分腺泡细胞变性、坏死;术后6 h、12 h可见大量炎症细胞浸润，片状出血，胰腺小叶结构破坏，大量腺泡细胞坏死。胰腺组织HE染色，光镜下可见胰腺实质大片坏死，间质出血并有大量炎症细胞浸润，小叶轮廓破坏。

UT组1 h、3 h可见胰腺间质轻度水肿，6 h除间质水肿外，有炎症细胞浸润及点状出血坏死，12 h炎症细胞浸润进一步增加，有局灶坏死。UT组各时点与SAP组相比，胰腺病理损伤明显减轻;光镜下可见胰腺实质有小片状坏死灶，间质出血并仍有较多的炎症细胞浸润。各组不同时点胰腺组织病理评分见表5。

表5 各组不同时点胰腺组织病理评分Table 5.Pathological scores of pancreatic tissues in each group at various time point(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs SAP group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h Control 1.89±0.23 1.96±0.14 2.37±0.36 3.08±0.27 SAP 5.73±0.35＊＊ 7.40±0.21＊＊ 10.22±0.43＊＊ 11.15±0.81＊＊SAP+UT 3.29±0.30 4.13±0.27 6.34±0.51# 7.62±0.42#

6 肺组织病理学改变及评级

对照组各时点肺组织未见明显水肿及炎症细胞浸润，亦未见出血和肺泡细胞坏死。光镜下见肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见明显渗出液。

SAP组术后1 h亦未见明显变化，组织病理评级为0级;术后3 h可见肺间质水肿，少量炎症细胞浸润，偶见点状出血和肺泡细胞坏死，组织病理学评级为Ⅰ级;术后6 h见肺泡隔增宽，肺内小血管扩张充血，有较多的中性粒细胞浸润，组织病理学评级为Ⅱ级;术后12 h镜下见肺间质水肿，弥漫性出血，肺泡结构紊乱，大量肺泡细胞坏死。血管扩张瘀血，有大量炎症细胞浸润，组织病理学评级为Ⅲ级。

UT组各时点肺病理学改变与SAP组相比，3 h后各时点症状明显减轻，未见斑片状坏死，肺泡间隔变薄，仍有一些炎症细胞浸润，以中性粒细胞为主，组织病理学评级为I级。

讨论

SAP是消化系统的急腹症，病程凶险，发展快，死亡率高［6，7］。其发病机制尚未完全明了，目前认为在其形成过程中，炎症细胞的浸润起着重要作用，在发病早期阶段就可出现全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)且并发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，造成胰腺以外的重要脏器发生功能性和器质性的损伤［6］。本实验结果表明，SAP组和对照组术后1 h，胰腺组织中FKN mRNA表达水平升高不明显，与对照组相比，无显著差异。然而SAP大鼠术后3 h－12 h胰腺组织中FKN mRNA的表达明显高于对照组，显著差异。此时我们从病理切片中观察到胰腺组织的病理损害程度不断加重，提示FKN可能在SAP发病过程中起了重要作用。研究表明［8－10］，急性胰腺炎(AP)时受损的胰腺组织作为抗原或炎症刺激物激活巨噬细胞等炎症细胞释放大量细胞因子，进而通过扳机样作用，触发炎症介质瀑布样级联反应，细胞因子网络和免疫功能紊乱很可能是AP极易从局部病变迅速发展为SIRS和多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)的实质所在。

趋化因子是一类控制细胞定向迁移的细胞因子，其功能的行使由趋化因子受体介导，趋化因子与其受体的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统和组织器官间的定向迁移，使免疫细胞到达感染部位，执行清除感染，维持组织细胞平衡的功能。本实验中，模型组血清中FKN水平随着时间的延长不断增高，SAP组和对照组术后1 h，血清中检测到有少量的FKN表达;SAP大鼠术后3 h－12 h检测到血清FKN水平不断升高，与对照组相比差异显著。提示牛磺胆酸钠的作用，使胰腺组织不断释放出趋化因子FKN并进入血流。循环中的FKN因子对中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等均有趋化作用，使机体内大量炎症细胞不断进入炎症组织。此时我们病理组织切片观察到，在3 h－12 h的胰腺组织中有大量炎症细胞浸润，并伴有胰腺组织的坏死。随着时间的延长，胰腺组织病理学积分也不断增高。我们推测，FKN因子的大量渗出进入血流，诱导了大量炎症细胞游走进入胰腺组织，促进了炎症级联反应的发生和发展，从而导致了大量胰腺腺泡细胞的坏死。

UT是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白。UT属于蛋白酶抑制剂，不仅对胰蛋白酶、透明质酸酶等多种酶有抑制作用，还具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。本研究结果显示，我们在大鼠SAP模型建立后立即皮下注射UT，6 h后血清淀粉酶显著下降，胰腺组织病理改变明显减轻，提示UT对SAP有较明显的治疗作用。我们还注意到，经荧光定量PCR检测胰腺组织FKN mRNA的表达，在3 h后B组胰腺组织中FKN mRNA表达较A组胰腺组织中表达减弱，检测其血清中FKN蛋白的含量，B组血清FKN的含量也较A组血清明显降低。提示UT能显著改善大鼠SAP严重程度，其机制可能与抑制了趋化因子FKN表达有一定关系。

急性胰腺炎相关的急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是急性胰腺炎SIRS在肺部的表现，严重者出现急性呼吸性窘迫综合征(ARDS)和MODS。SAP合并ALI，病情凶险，死亡率高，约1/3的SAP合并ALI和ARDS，并且约60%死亡病例是由后2种并发症引起［11－13］。本实验中我们观察到，SAP大鼠术后1 h肺部FKN mRNA表达开始升高，但此时统计学分析两者间无显著差异。病理切片组织学观察显示此时未见明显变化。SAP大鼠术后3 h－12 h检测肺部组织FKN mRNA表达与对照组比较，明显增加，此时病理组织学观察显示，在3 h时点可见到有少量炎症细胞浸润及肺间质水肿等病理现象。术后6 h－12 h可见大量炎症细胞浸润，并伴有水肿、出血和细胞坏死。提示FKN在SAP相关的ALI中起了重要作用。同时，本研究结果显示SAP大鼠术后3 h FKN就在肺组织内明显表达。而我们早先对MCP－1在大鼠急性胰腺炎肺损害中的作用研究显示，MCP－1在大鼠术后3 h肺组织内表达尚未明显升高［14，15］，提示FKN很可能较早参与了AP相关的ALI的发生，这一结果为研究急性胰腺炎相关ALI的发生机制提供了基础理论依据。

我们在研究中注意到，随着实验时间的延长，各实验对照组的结果也随之增高。造成这样的结果我们认为可能有两个原因，一是由于手术创伤引起对照组趋化因子表达水平的增高;二是由于在造模过程中我们采用的是逆向胆胰管内注射的方法，胆胰管损伤及逆向注射时一定的压力可能会引起局部组织损伤，也可能会导致各对照组实验结果的增高。我们认为这一结果比较客观地反映了实验过程中其它因素对实验结果的影响，实验对照组是实验设计中必不可少的。

趋化因子及其受体的表达及功能异常将导致免疫细胞不能在正常位置行使其正常功能。因此，以趋化因子及其受体分子为治疗靶点，通过激活或者拮抗趋化因子受体的信号转导来调控趋化因子系统的功能，可望用于控制和治疗相关疾病。

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