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氧化应激在高脂高盐饮食伴高糖饮水诱导的代谢综合征肾病大鼠中的作用*

2011-08-02张道友吴海兵李芳霞

中国病理生理杂志 2011年11期
关键词:超氧阴离子肾脏

孔 祥, 张道友, 张 妍, 吴海兵, 李芳霞

(皖南医学院1药理学教研室,国家中医药管理局中药药理三级实验室,2弋矶山医院肾内科,3弋矶山医院消化内科,安徽 芜湖 241001)

代谢综合征(metabolic syndrome,MS)是以胰岛素抵抗为病理生理基础,伴有中心性肥胖、高血脂、高血压、糖尿病或空腹血糖增高的症候群,已经成为危害人类生命健康的全球性问题[1]。近年来研究证实MS不仅是心、脑血管疾病的危险因素,亦可导致肾脏损伤。文献报道MS能够引起进行性肾小球硬化,增高白蛋白尿和慢性肾病的发病率[2]。但是,MS肾病的发病机制尚未完全阐明,其主要原因之一是缺乏能充分模拟临床特征的动物模型。

目前,长期饮食诱导(高脂和/或高糖喂饲)是建立MS大鼠模型的一种常用方法[3]。此方法建立的模型能够模拟人类MS大多数特征,但未见肾脏功能和结构损伤的报道。实际上,长期摄入单纯高脂、高糖饮食能否引起肾脏损伤尚存在争议[4,5]。然而,有文献报道高盐摄入可引起大鼠高胰岛素血症、高血压和肾脏损伤[6]。因此,我们通过长期高脂高盐饮食和高糖饮水喂饲Sprague-Dawley(SD)大鼠,以期建立一种MS肾病动物模型。

氧化应激是指机体在遭受各种刺激时,自由基产生和抗氧化防御系统失衡的一种病理状态,在高血脂、高血压和糖尿病的发生和发展中起着不可忽视的作用[7]。然而氧化应激在MS肾病中的作用未见相关报道。故本研究在建立MS肾病大鼠模型的基础上,探讨肾脏中氧化应激的状态、产生机制及其对肾脏结构和功能的影响。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 葡萄糖、甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司;白蛋白和胰岛素(insulin,Ins)放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所;尿蛋白、肌酐、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)、抑制超氧阴离子能力(inhibiting superoxide anion capacity,ISAC)、丙 二 醛 (malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;Cu/Zn-SOD、NADPH氧化酶亚单位 p47phox和 p22phox抗体购自 Santa Cruz;β-actin抗体购自武汉博士德公司;辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司;ECL试剂盒购于Pierce。

1.2 动物和饲料 7周龄雄性SD大鼠20只,体重200-240 g,购自浙江省试验动物中心,许可证号为SCXK(浙)20080033。大鼠饲料购自南京青龙山实验动物中心。高脂高盐(high-fat and high-salt,HFS)饲料配方见作者之前报道[8]。(1)正常饲料(g·kg-1):蛋白质217,碳水化合物462,脂肪44,纤维素80,氯化钠4,混合矿物质24,混合维生素2。HFS饲料(g·kg-1):蛋白质 211,碳水化合物 330,脂肪200(含15%猪油和1%胆固醇),纤维素65,氯化钠40,混合矿物质24,混合维生素2。(2)饲料热量组成和密度如下:正常饲料,蛋白质占总热量27.8%,碳水化合物 59.3%,脂肪 12.8%,3.1 kCal·g-1;HFS饲料,蛋白质21.3%,碳水化合物45.4%,脂肪33.3% ,4.0 kCal·g-1。

2 方法

2.1 模型建立及处理 大鼠分笼饲养,每笼1只,室温(22~24)℃,自由进食饮水,适应1周后随机分为2组,正常对照组(control,n=10,给于普通饲料和正常饮水)和模型组(MS,n=10,给于 HFS饲料和20%蔗糖饮水)。2组大鼠按此条件持续喂养20周。每周测量1次体重(body weight,BW)。每4周用ALC-NIBP无创血压测定系统,测清醒状态下大鼠尾动脉收缩压(systolic blood pressure,SBP)[8,9]。于20周末代谢笼收集24 h尿液后,大鼠麻醉后腹主动脉取血,离心分离血清。称内脏脂肪(visceral fat weight,VFW)和肾脏湿重(kidney weight,KW),计算其占体重比值。取部分肾脏用10%甲醛固定,用于PAS和Masson染色。其余冻存于-80℃冰箱备用。

2.2 血清和尿液指标检测 酶比色法测血清TC、TG和空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)含量,放射免疫法测血清空腹胰岛素(fasting insulin,FIns)水平,计算稳态胰岛素评价指数(homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA -IR)=[FBG(mmol/L)× FIns(mU/L)/22.5][10]。除蛋白法测血清和尿肌酐含量,并计算肌酐清除率(creatinine clearance,Ccr)=[尿肌酐(μmol/L)×24 h尿量(mL)/血肌酐(μmol/L)]×[1000/BW(g)]×[1/1440(min)][11]。Bradford 法测尿蛋白含量,计算尿蛋白排泄率(urinary protein excretion,UPE)。放射免疫法测尿白蛋白水平,并计算尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion,UAE)。电极法测定尿钠含量,并计算尿钠排泄率(urinary sodium excretion,USE)。

2.3 肾组织生化指标检测 将肾组织剪碎后置于匀浆器,加入RIPA裂解液和混合蛋白酶抑制剂,反复碾碎组织,4℃ 12000×g离心15 min,取上清用Bradford法测蛋白浓度。采用比色法测肾匀浆TAOC和抗超氧阴离子能力、MDA含量以及SOD、CAT和GPX活性。

2.4 Western blotting 检测肾脏 p47phox、p22phox和 Cu/Zn-SOD蛋白表达 以80 μg蛋白/泳道上样,经SDS-PAGE凝胶电泳后,电转膜至NC膜,室温封闭2 h。洗膜后分别加入Ⅰ抗(p47phox1∶800,p22phox1∶500,Cu/Zn -SOD 1∶1000,β -actin 1∶500 稀释)4℃孵育过夜。洗膜后Ⅱ抗37℃孵育1.5 h。ECL化学发光法显色,拍摄照片。根据积分吸光度(integrated absorbance,IA)值对比分析条带强弱,以βactin为内参照进行半定量分析。

2.5 肾脏病理检查 切片常规脱蜡脱水,PAS和Masson染色后光镜观察肾小球硬化(glomerulosclerosis,GS)和肾小管间质损伤(tubulointerstitial injury,TI)。TI判断标准包括:皮质区肾间质纤维化、炎症细胞浸润和肾小管扩张或萎缩。采用盲法半定量评估 GS 和 TI程度,评分标准如下[12,13]:0 分,正常;1分,病变面积<25%;2分,面积26% ~50%;3分,面积51% ~75%;4分,面积>76%。每张切片至少观察50个肾小球(×400)和皮质区视野(×100),并计算其评分平均值。

3 统计学处理

结 果

1 两组大鼠一般状况的比较

入选分组时两组大鼠BW无明显差别[(267.1±10.5)g vs(269.5 ±14.6)g,P >0.05]。20 周时,MS大鼠BW、VFW、VFW/BW和KW较正常大鼠明显增高(P<0.05)。MS大鼠KW/BW与正常大鼠无显著差异(P>0.05),见表1。

入选分组时两组大鼠SBP无明显差别[(120.2±8.9)mmHg vs(118.8 ±8.4)mmHg,P >0.05]。8周时MS大鼠SBP升高[(139.6±9.3)mmHg vs(125.9±8.2)mmHg,P<0.05]。20周时 MS大鼠SBP[(149.4±9.4)mmHg]明显高于正常大鼠[(119.3 ±8.6)mmHg,P <0.05],见图1。

表1 两组大鼠一般状况的比较Table 1.Comparison of physiological parameters in the two groups(.n=10)

表1 两组大鼠一般状况的比较Table 1.Comparison of physiological parameters in the two groups(.n=10)

*P <0.05 vs control group.

Group BW(g) VFW(g) KW(g)VFW/BW(mg·g-1)KW/BW(mg·g-1)Control 558.8 ±35.1 16.0±2.0 2.52 ±0.32 28.7±4.2 4.51±0.51 MS 657.2 ±55.1*46.8±7.9* 3.26 ±0.42* 71.0±9.8*4.97±0.61

Figure 1.Comparison of SBP in the two groups..n=10.*P<0.05 vs MS group.图1 两组大鼠SBP的比较

2 两组大鼠血脂、血糖、胰岛素水平和稳态胰岛素评价指数的比较

MS大鼠TC和TG明显高于正常大鼠(P<0.05)。两组大鼠血清FBG无明显差别(P>0.05)。MS大鼠血清FIns水平和HOMA-IR较正常大鼠显著增高(P<0.05),见表2。

表2 两组大鼠TC、TG、FBG、FIns和HOMA-IR的比较Table 2.Comparison of TC,TG,FBG,FIns and HOMA-IR in the two groups(.n=10)

表2 两组大鼠TC、TG、FBG、FIns和HOMA-IR的比较Table 2.Comparison of TC,TG,FBG,FIns and HOMA-IR in the two groups(.n=10)

*P <0.05 vs control group.

Group TC(mmol·L-1)TG(mmol·L-1)FBG(mmol·L-1)FIns(mU·L-1)HOMA-IR Control 1.42 ±0.65 0.88±0.29 5.33 ±0.49 38.7±22.1±7.19.9 9.2±2.4 MS 2.50 ±0.70*1.48±0.41*5.99 ±0.95 82.3±14.9*

3 两组大鼠尿钠、蛋白和白蛋白排泄率及肌酐清除率的比较

两组大鼠UPE和Ccr无显著差异(P>0.05)。MS大鼠 USE和UAE较正常大鼠明显增高(P<0.05),见表 3。

4 两组大鼠肾脏T-AOC、ISAC和MDA含量的比较

MS大鼠肾脏T-AOC和ISAC较正常大鼠显著降低(P<0.05),MDA含量显著增加(P<0.05),见表4。

表3 两组大鼠USE、UPE、UAE和Ccr的比较Table 3.Comparison of USE,UPE,UAE and Ccr in the two groups(.n=10)

表3 两组大鼠USE、UPE、UAE和Ccr的比较Table 3.Comparison of USE,UPE,UAE and Ccr in the two groups(.n=10)

*P <0.05 vs control group.

Control 1.1 ±0.4 7.0 ±2.4 13.3±3.7 2.55 ±0.92 MS 15.1±2.5* 11.2±6.0 39.5±9.5*1)2.77 ±0.84

5 两组大鼠肾脏抗氧化酶活性的比较

MS大鼠肾脏SOD活性显著低于正常大鼠(P<0.05),GPx和 CAT活性两组间无显著差异(P>0.05),见表 4。

6 两组大鼠肾脏 p47phox、p22phox和 Cu/Zn-SOD蛋白表达的比较

MS大鼠肾脏p47phox蛋白表达(0.63±0.11)较正常大鼠显著增高(0.34±0.08,P<0.05),Cu/Zn-SOD蛋白表达(0.50±0.07)较正常大鼠显著降低(0.83±0.12,P<0.05)。两组大鼠 p22phox蛋白表达无明显差别(0.31±0.08 vs 0.21±0.05,P>0.05),见图2。

表4 2组大鼠肾脏T-AOC、ISAC、MDA含量和抗氧化酶活性的比较Table 4.Comparison of renal T-AOC,ISAC,MDA level and antioxidant enzyme activities in the two groups(.n=10)

表4 2组大鼠肾脏T-AOC、ISAC、MDA含量和抗氧化酶活性的比较Table 4.Comparison of renal T-AOC,ISAC,MDA level and antioxidant enzyme activities in the two groups(.n=10)

*P <0.05 vs control group.

Group T-AOC(103U·g-1protein)ISAC(103U·g-1protein)MDA(μmol·g-1protein)SOD(103U·g-1protein)GPX(103U·g-1rotein)CAT(103U·g-1protein)Control 4.99 ±1.40 101.2 ±15.9 4.87 ±0.68 150.9 ±31.3 24.1 ±6.4 20.9 ±2.5 MS 2.48 ±0.45* 69.9 ±11.5* 7.74 ±1.51* 92.5 ±19.7*21.9 ±5.8 21.4 ±2.6

Figure 2.Renal protein expression of p47phox,p22phoxand Cu/Zn -SOD in the two groups.Representative bands and integrated absorbance(IA)normalized to the corresponding βactin were shown..n=4.*P <0.05 vs control group.图2 两组大鼠肾脏p47phox、p22phox和Cu/Zn-SOD蛋白表达的比较

7 两组大鼠肾脏组织形态学比较

MS大鼠肾脏肾小球基底膜增厚,系膜细胞增生,基质增多,GS评分(1.10±0.25)较正常大鼠(0.18±0.07)明显升高(P<0.05)。MS大鼠未见明显肾间质纤维化、炎症细胞浸润和肾小管扩张或萎缩,TI评分两组间无显著差异,见图3。

Figure 3.Representative micrographs of the kidneys in control(A)and MS(B)rats(PAS staining,×400).图3 PAS染色观察两组大鼠肾脏组织形态改变

讨 论

本实验结果显示,予以HFS饲料和高糖饮水20周后,SD大鼠体重、内脏脂肪重量、血脂、血压明显增高,且伴有显著胰岛素抵抗,说明MS模型制备成功。进一步观察发现,大鼠肾脏湿重、UAE和GS评分亦显著升高,UPE、Ccr和肾脏湿重占体重比值有增高趋势,TI评分无显著变化,提示MS大鼠伴有早期的肾脏功能和结构损伤。

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)等产生过多,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。ROS主要包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等,其中超氧阴离子可与NO结合生成一种极为强大的氧化剂过氧亚硝酸盐阴离子,导致自由基反应加剧,加重组织损伤[14]。本实验发现MS大鼠肾脏T-AOC和抗超氧阴离子能力较正常大鼠降低,MDA含量增加,说明ROS在MS肾病大鼠生成明显增多。进一步研究发现在MS大鼠肾脏,超氧阴离子主要来源之一的NADPH氧化酶亚单位p47phox蛋白表达明显增加。上述结果提示NADPH氧化酶活化,生成大量超氧阴离子,进而激活各种信号转导途径是导致MS大鼠肾脏损伤的可能机制。

机体清除ROS的主要抗氧化酶系统包括SOD、GPx和CAT。SOD主要作用是清除超氧阴离子,GPx和CAT主要清除过氧化氢。文献报道在各种ROS中,过氧化氢和NO等具有非常重要的信号作用,毒性作用很弱,而羟自由基和超氧阴离子毒性强,是导致细胞氧化损伤的主要介质[15]。本实验发现MS大鼠肾脏SOD活性和Cu/Zn-SOD蛋白表达较正常大鼠明显降低,提示超氧阴离子清除减少亦是导致MS大鼠肾脏损伤的可能机制。

综上所述,长期HFS饮食和高糖饮水喂饲SD大鼠可建立具有大部分临床特征的MS肾病大鼠模型。NADPH氧化酶表达增高和SOD表达减少而引起的氧化应激状态在MS大鼠肾脏损伤的发生发展中起一定作用。

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