尿酸诱导树突状细胞成熟的信号转导机制研究*
2011-08-02马晓军伍定辉陈小苹田德英
马晓军, 伍定辉, 陈小苹, 田德英
(1广东省人民医院,广东省医学科学院感染科,广东 广州 510080;2厦门市第一医院杏林分院肺科,福建 厦门 361001;3华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科,湖北 武汉 430060)
树突状细胞(dendritic cells,DCs)在获得性免疫应答中占据关键位置。我们在前期研究中已证实,尿酸分子可以刺激DCs成熟,可增强乙肝DCs疫苗的免疫效应[1,2]。本研究中,我们进一步对尿酸刺激DCs成熟过程中,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路(ERK1/2、p38、JNK)及核因子NF-κB的信号活化情况进行观察,以探讨尿酸刺激DCs成熟的分子机制,进一步阐述尿酸作为乙肝治疗性疫苗免疫佐剂的作用机理。
材料和方法
1 主要试剂
尿酸(uric acid,UA)购自 Sigma-Adrich,按5 g/L浓度溶解在0.1 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.5~9.0)中,静置 72 h 以上[2,3]。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)为Sigma产品,以PBS配制成20 mg/L,灭菌后4℃贮存。p38 MAPK抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂 PD98059、JNK抑制剂 SP600125和NF-κB抑制剂PDTC均购自Santa Cruz。使用前溶于DMSO。兔抗磷酸化的ERK单克隆抗体、兔抗磷酸化的p38单克隆抗体、兔抗NF-κB p65亚基的多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Santa Cruz。细胞核蛋白质提取试剂盒NE-PERTM nuclear and cytoplasmic extraction reagent、T - PERTM tissue protein extraction reagent及BCA protein assay reagent均为Pierce产品。预染蛋白marker购自碧云天生物技术研究所。ECL:分A和B 2种试剂,为Santa Cruz产品。
2 大鼠骨髓来源树突状细胞的培养
见前期研究[1,2],体外分离培养获得未成熟DCs。
3 ERK1/2、p38、JNK 信号蛋白及 NF - κB p65蛋白的检测
3.1 DCs的刺激及收集 收获前述按常规方法培养7 d的DCs,调整细胞浓度为1×109cells/L,分于数个Eppendorf管,每管1 mL,置37℃、5%CO2箱孵育。以1 mg/L LPS刺激45 min作为阳性对照,仅加DMSO处理的为阴性对照。用200 mg/L尿酸(为排除LPS污染,同时加入50 mg/L多黏菌素B)或尿酸联合各抑制剂 (SB20358020 μmol/L、PD9805940 μmol/L、SP60012520 μmol/L 或 PDTC 20 μmol/L)刺激15、30、45 min,调整刺激开始的时间,使上述刺激同时结束。然后立即收获细胞,准备提取细胞蛋白和细胞核。
3.2 树突状细胞总蛋白与核蛋白的提取 (1)树突状细胞总蛋白的提取:经刺激后,即刻离心DCs,沉淀细胞,弃上清,用T-PERTM tissue protein extraction reagent提取全蛋白,然后用BCA法测定浓度。调节至前后左右一致后,样品每20 μL与4 μL 6倍蛋白上样缓冲液混匀,于100℃水浴煮沸5 min后,-20℃贮存备用。(2)树突状细胞核蛋白的提取:经刺激过的 DCs细胞用 PBS洗1遍后,用NEPERTM nuclear and cytoplasmic extraction reagent提取核蛋白,同上述方法将蛋白浓度调节一致,样品加入蛋白上样缓冲液于100℃水浴煮沸5 min后,-20℃贮存备用。(3)SDS-PAGE电泳:制作15%SDS-PAGE凝胶电泳分离胶10 mL;按序加样,每条加样槽加50 μg蛋白提取液,用β肌动蛋白(βactin)作为内参照。电泳、蛋白转移到PVDF膜上,丽春红染色并标记方向,标出marker所在位置。先后加入Ⅰ抗,兔抗 NF-κB p65抗体(1∶1000)、β -actin单克隆抗体,Ⅱ抗(1∶5000的羊抗兔HRP标记IgG);ECL显色。(4)分析数据:胶片摄像,用SensiAnsy凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净吸光度值。计算其与β-actin的比值。
4 信号转导分子抑制剂对DCs表面分子表达及IL-12 p70分泌水平的影响
4.1 树突状细胞的刺激培养 按常规方法培养第7 d的DCs,加入200 mg/L尿酸和重组细胞因子刺激培养48 h,同时分别加入信号转导分子抑制剂p38 MAPK 抑制物 SB203580(20 μmol/L)、ERK1/2 抑制物 PD98059(40 μmol/L)、JNK 抑制物 SP600125(20 μmol/L)和NF-κB 抑制物PDTC(20 μmol/L)培养。以未用信号转导分子抑制剂为平行对照组,仅加等量DMSO处理的为阴性对照。
4.2 DCs表面分子测定 48 h后收集细胞,荧光染色后流式细胞仪测定CD83、CD86和IA/IE的表达。
4.3 IL-12 p70的分泌水平 收集细胞上清,严格按ELISA试剂盒说明进行操作,酶标仪检测IL-12 p70的分泌水平。简言之,抗小鼠IL-12 p70单抗包被于酶标板上,先后加入标本和标准品、生物素化的抗小鼠IL-12抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素,洗涤,再加入显色剂、终止液等,在450 nm处测A值,通过绘制标准曲线求出标本中IL-12 p70浓度。
5 统计学处理
结 果
1 尿酸作用于DCs可引起部分信号转导分子的激活
图1中分析了尿酸不同作用时点信号转导分子ERK、JNK和p38的磷酸化情况及NF-κB的核内转位情况。尿酸刺激后15 min,p- p38、p-ERK1/2、p-JNK和NF-κB p65表达量明显增加,30 min时达到高峰,45 min时则开始下降,与DMSO对照组相比,P<0.05。尿酸可使相关信号分子的活化程度提高4.5~5.9倍。使用抑制剂后,相应磷酸化信号蛋白表达不能测出。阳性对照组LPS组上述分子在45 min时仍大量表达,与尿酸30 min时表达值无显著差异,P>0.05。上述结果表明,尿酸刺激 DCs后,促进了p38、JNK、ERK等的磷酸化。NF-κB通常存在于胞浆中,在细胞核内检测到NF-κB p65,提示尿酸诱发了NF-κB活化,促进了NF-κB向核内转位。
2 信号转导分子抑制剂对DCs成熟及分泌IL-12 p70水平的影响
DCs表面分子的表达如表1、图2所示。与未用相应抑制剂相比,使用 SB203580、SP600125、PDTC等抑制剂处理后,DCs表面分子表达和IL-12 p70分泌水平均出现下降。其中,以SB203580的作用最明显。使用PD98059后,则出现DCs表面分子表达和IL-12 p70分泌出现相反的变化趋势。
与尿酸单独刺激组比较,使用 SB203580后,CD83、CD86表达和 IL-12 p70分泌明显下降(P<0.01),IA/IE表达出现下降(P<0.05);使用SP600125后,CD83、CD86表达和IL-12 p70分泌明显下降,IA/IE表达轻度下降(P>0.05);使用PDTC后,CD86的表达明显下降(P<0.01),CD83和IA/IE表达出现下降(P<0.05),而IL-12 p70的分泌轻度下降(P>0.05);使用 PD980059后,CD83、CD86、IA/IE表达及IL-12 p70分泌水平则出现上升(P<0.05)。
表1 各组DCs表面分子表达及分泌IL-12 p70水平的影响Table 1.Expression of molecules on the surface of DCs and IL-12 p70 production in DCs(.n=5)
表1 各组DCs表面分子表达及分泌IL-12 p70水平的影响Table 1.Expression of molecules on the surface of DCs and IL-12 p70 production in DCs(.n=5)
△P <0.05,△△P <0.01 vs DMSO;*P<0.05 ,**P <0.01 vs DMSO+UA.
Group CD83(%) CD86(%) IA/IE(%) IL-12 p70(μg/L)DMSO 22.37 ±4.78** 36.32 ±2.79** 29.28 ±3.21** 2.62 ±0.25**DMSO+UA 51.78 ±5.87△△ 80.28 ±3.52△△ 78.92 ±3.38△△ 4.21 ±0.29△△SB203580+UA 36.73 ±3.16△△** 43.48 ±3.28△** 73.09 ±2.52△△* 3.12 ±0.27△**PD98059+UA 58.81 ±3.25△△* 84.98 ±2.44△△* 84.68 ±3.47△△* 4.87 ±0.29△△*SP600125+UA 43.92 ±4.35△△* 74.45 ±3.21△△* 78.36 ±4.15△△ 3.46 ±0.34△△*PDTC+UA 39.87 ±5.31△△* 51.47 ±4.32△△** 71.36 ±5.34△△* 3.85 ±0.31△△
讨 论
作为内源性“危险信号”的尿酸,具有诱导DCs成熟的良好佐剂活性,但其信号转导途径至今尚未阐明。研究表明,MAPKs、核因子κB等信号通路激活是DCs成熟的重要机制。NF-κB通路已证实对DCs成熟有着重要作用,如NF-κB基因敲除小鼠的DCs存在严重功能缺陷[4]。LPS、TNF- α 以及半抗原DNCB、Nicl2等对DCs刺激的实验中发现,不同的DCs成熟刺激剂能通过控制和平衡ERK、JNK和p38 MAPK等MAPKs的磷酸化,从而诱导DCs成熟和激发相应的免疫反应;使用不同信号分子抑制剂阻断相应信号通路,对 DCs的成熟具有明显不同影响[5-8]。
本研究观察到,对小鼠骨髓来源的未成熟DCs,尿酸刺激 15 min后,即可见 ERK1/2、JNK、p38 MAPK及NF-κB等信号分子的磷酸化蛋白,30 min后到达高峰;使用抑制剂后,相应磷酸化信号蛋白表达不能测出。这表明,DCs的MAPKs及NF-κB信号通路可被尿酸所激活。
Figure 1.Expression of signal transduction molecules in dendric cells simulated by uric acid.DCs were obtained from murine bonemarrow and cultured in vitro.After immature DCs were stimulated with uric acid(200 μg)and NF - κB inhibitor PDTC(20 μmol/L)or MAPKs inhibitors SB203580(20 μmol/L),PD98059(40 μmol/L)or SP600125(20 μmol/L)for 15,30 or 45 min,cytoplasmic or nuclear extracts were collected and were subject to immunoblot analysis with specific antibodies.Cell lysates from DCs treatment with LPS or DMSO served as controls.A:expression of p-p38;B:expression of p-ERK1/2;C:expression of p-JNK;D:expression of NF-κB p65..n=5.#P<0.05 vs DMSO.图1 尿酸刺激树突状细胞信号分子蛋白活化表达
大量表达共刺激分子和分泌IL-12是DCs成熟的重要标志。本研究进一步发现,抑制p38、JNK、NF-κB等信号通路,尿酸诱导的CD83、CD86和IA/IE表达受到明显抑制,IL-12 p70分泌下降;抑制ERK1/2信号通路,则促进了CD86、CD83、IA/IE表达,提高了IL-12 p70的分泌。这表明,MAPKs及NF-κB等信号活化及效应强度的平衡直接影响到尿酸刺激DCs表型和功能成熟程度;p38 MAPK、JNK信号蛋白的活化起着正向调节作用,而ERK信号通路则负向调节。其中,p38 MAPKt和NF-κB通路对尿酸刺激DCs成熟过程中起着主导作用。
综上所述,本研究结果表明,尿酸能刺激树突状细胞 MAPKs(p38、ERK1/2和 JNK)、NF-κB 等信号通路的活化,而上述信号通路的活化程度及持续效应时间则决定着DCs成熟程度,这可能是尿酸诱导DCs成熟的分子机制之一。该发现将为尿酸作为乙肝疫苗免疫佐剂的应用提供科学依据;也为以DCs作为靶细胞,通过MAPKs抑制剂调节DCs的成熟和功能,进而调控机体免疫反应的应用研究建立科学基础。
Figure 2.Effect of signal transduction molecule inhibitors on expression of molecules on the surface of DCs and IL-12 p70 production in DCs.DCs were obtained from murine bone-marrow and cultured in vitro.After treatment with uric acid and PDTC(20 μmol/L),SB203580(20 μmol/L),PD98059(40 μmol/L)or SP600125(20 μmol/L)for 48 h,DCs were collected.Cell surface markers were analyzed by flow cytometry.IL-12 p70 production in cultured cell supernatants was detected using ELISA..n=5.△P<0.05,△△P<0.01 vs DMSO;*P<0.05,**P<0.01 vs DMSO+UA.图2 信号转导分子抑制剂对DCs表面分子表达及IL-12 p70分泌水平的影响
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