卵巢上皮癌中血管生成拟态和E－钙黏蛋白表达及其临床意义

俞 岚， 武世伍， 宋文庆， 周 蕾， 承泽农

(蚌埠医学院第一附属医院病理科，安徽省感染与免疫重点实验室，安徽 蚌埠 233030)

卵巢癌是女性生殖道恶性肿瘤中死亡率最高的一种，70%的患者就诊时已属晚期，5年生存率低于30%。肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)指的是在没有内皮细胞的参与下，细胞表型出现转化，通过自身变形和基质重塑而直接形成特有的微循环管道，通道内无内皮细胞衬覆。拟态血管生成使卵巢癌更具侵袭性和转移性。VM结构中癌细胞之间以及癌细胞与基质间黏附作用的存在是通过细胞黏附分子(cellular adhesion molecules，CAMs)发挥关键性的作用，其中E－钙黏蛋白(E－cadherin，E－cad)是黏附分子中的重要成员，其表达程度的变化直接关系到肿瘤的生物学行为。本研究通过对80例上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)根治性手术病例标本VM及E－cad水平的检测，探讨其表达与卵巢癌侵袭、转移以及预后的关系。

材料和方法

1 材料

1.1 一般资料 收集蚌埠医学院第一附属医院病理科2000年1月～2002年12月存档石蜡包埋EOC组织标本80例(术前未行放、化疗)和卵巢良性上皮性肿瘤组织标本20例，所有病例均有完整的临床、病理及随访资料，入选病例随访至患者死亡或截止2010年11月，随访时间为7～96个月。根据国际抗癌联盟(International Union Against Cancer，UICC)2002版肿瘤PTNM分期标准进行分期，早期(FIGOⅠ、Ⅱ期)卵巢癌40例，晚期(FIGOⅢ、Ⅳ期)卵巢癌40例;浆液性癌70例，黏液性癌10例;有腹腔脏器及淋巴结转移者38例，有腹水者21例。年龄19～76岁，中位年龄50.2岁，≥50岁33例，＜50岁47例;肿瘤平均最大长径(diameter，D)为5.3 cm，D≥5.0 cm 48例，D＜5.0 cm 32例。选择20例良性上皮性卵巢肿瘤患者手术切除标本作为良性对照组。复阅上述患者的病理切片，选取存档的患者手术标本石蜡块进行切片，厚度4 μm。

1.2 试剂 鼠抗人 CD34单克隆抗体(克隆号QBEnd/10)以及鼠抗人E－cad单克隆抗体［克隆号:MM(36B5)］，ElivisionTMPlus试剂盒以及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。过碘酸Schiff(periodic acid－Schiff，PAS)染色液为蚌埠医学院第一附属医院病理科配制。

2 方法

2.1 免疫组织化学ElivisionTMPlus法 将石蜡标本以4 μm厚连续切片，烤干，于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水。免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以PBS液代替Ⅰ抗作空白对照。

2.2 CD34和PAS套染 CD34免疫组化染色，DAB显色后，水流冲洗1 min终止显色反应，将切片置于0.5%高碘酸溶液中氧化5～8 min。流水冲洗2 min，再用蒸馏水洗1次，于暗处置于Schiff液中染色10～20 min，然后用0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次1 min，流水冲洗2 min;此后依次苏木素浅染细胞核、盐酸乙醇分化、返蓝、脱水透明以及中性树胶封片。

2.3 微血管密度(microvessel density，MVD)计数CD34主要表达在血管内皮细胞的细胞浆和胞膜，从而可以通过CD34的阳性表达来进行MVD计数，参照文献［1］来计数。

2.4 结果判定 CD34和E－cad均以细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。采取二次计分法:每例标本随机计数5个高倍视野(×400)，计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比并计分。首先将染色强度计分:0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再将阳性细胞百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞＜10%，2分为11% －50%，3分为51%－75%，4分为＞75%。用染色强度得分和细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分≤2为阴性，＞2为阳性。免疫组化结果由高年资病理医师读片评定。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。VM和E－cad表达阳性组与阴性组生存分析用Kaplan－Meier法，组间比较用log－rank检验，多因素分析采用Cox回归多因素模型，VM和E－cad在EOC组织中表达与卵巢良性上皮性肿瘤组织、各临床及病理因素的相关性采用Fisher精确概率法检验。

结 果

1 卵巢EOC及良性上皮性肿瘤组织中VM及E－cad蛋白的表达

EOC组织中可检测到VM的存在，在苏木精－伊红(hematoxylin－eosin，HE)染色切片中查见由肿瘤细胞围绕形成的管腔样结构，腔内可见红细胞，见图1A;通过 CD34和 PAS套染，VM表现为PAS阳性染色但CD34阴性的管腔样结构，具有VM的肿瘤细胞附近不见坏死的肿瘤细胞，血管则表现为CD34及PAS染色均为阳性的管腔样结构;而CD34及PAS染色均为阴性的管腔样结构则并非VM，见图1B、C、D。E－cad主要表达于卵巢癌细胞浆，呈棕黄色，见图1E，但是有VM存在的EOC组织中E－cad多为阴性表达，见图1F。EOC组及良性上皮性肿瘤组中VM检测阳性率分别为57.4%(46/80)及0%(0/20)，E－cad蛋白阳性表达率分别为48.7%(39/80)及75.0%(15/20)，2组差异均显著(P ＜0.05)，见表1。

Figure 1.VM and E－cad expression in EOC(×400).A:HE staining(black arrows indicated VM);B～D:CD34 and PAS double staining(black arrows in B and C indicated VM，with PAS－positive and CD34－negative staining;red arrows in B，C and D indicated capillary，with positive staining of CD34 and PAS;the yellow arrow in D indicated the structure with negative staining of CD34 and PAS);E～F:immunohistochemical staining of E－cad was positive in E and negative in F.图1 EOC中的VM和E－cad表达

表1 EOC及卵巢良性上皮性肿瘤组织中VM和E－cad蛋白表达Table 1.VM and E －cad expression in EOC and benign epithelial tumor tissues［n(%)］

2 EOC中VM及E－cad表达与临床病理指标的关系

VM及E－cad表达阳性率与患者的年龄、肿瘤的大小、组织学类型以及患者有无腹水之间差异均无显著(P＞0.05)。EOC的分化越低，VM越多，差异显著(P＜0.05);PTNM分期Ⅰ－Ⅱ期VM阳性率为27.9%(12/43)，Ⅲ－Ⅳ期VM阳性率为91.9%(34/37)，VM组的PTNM分期与无VM组的PTNM分期相比差异显著(P＜0.05);VM组的患者更易发生腹腔脏器及淋巴结转移(P＜0.05)，见表2。EOC的分化越高，E－cad表达越强;伴有腹腔脏器及淋巴结转移的病例中E－cad表达降低，差异均显著(P＜0.05)。Ⅰ－Ⅱ期肿瘤中E－cad的阳性率为72.1%(31/43)，Ⅲ－Ⅳ期肿瘤中E－cad的阳性率为21.6%(8/37)，两者之间差异显著(P＜0.05)，见表2。

3 EOC中VM与E－cad表达的关系

Spearman相关分析显示，在EOC中VM与E－cad的表达呈负相关(r= －0.578，P＜0.01)，见表3。

4 多因素分析

将病理组织分化(分为高分化组、中分化组与低分化组)、年龄(分为≥50岁组与＜50岁组)、PTNM分期(分为Ⅰ－Ⅱ期组与Ⅲ－Ⅳ期组)、肿瘤直径(分为≥5.0 cm组与＜5.0 cm组)、腹腔脏器及淋巴结转移(分为有转移组与无转移组)、腹水(分为有腹水组与无腹水组)、VM(分为表达阳性组与阴性组)、MVD(因为MVD的均值为22.99±12.40，故以MVD＜22为阴性;MVD≥22为阳性)和E－cad(分为表达阳性组与阴性组)等因素引入Cox模型进行多因素分析，结果显示:VM、E－cad表达、PTNM分期和淋巴结转移是影响EOC根治术后患者预后的独立因素，见表4。

表2 80例EOC组织中VM和E－cad的表达与临床病理因素的关系Table 2.Correlation of VM and E－cad expression to clinicopathologic indexes of 80 cases of EOC［n(%)］

表3 EOC中VM与E－cad表达之间的关系Table 3.Correlation of VM to E－cad expression in EOC

5 生存率分析

本组病例总的5年生存率为40.0%。Kaplan－Meier生存分析显示VM阳性组与阴性组5年生存率分别为4.3%和88.2%，差异显著(P＜0.01);E－cad阳性组与阴性组5年生存率分别为71.8%和9.8%，差异显著(P＜0.01)，生存曲线见图2。

表4 80例EOC患者多因素分析Table 4.Multivariate survival analysis of 80 patients with EOC

讨 论

Figure 2.Survival curves of EOC patients with positive or negative VM(A)and E－cad expression(B).图2 VM和E－cad表达阳性或阴性对EOC患者生存率的影响

卵巢癌由于发病隐匿，早期难以察觉，就诊时多处临床晚期，肿瘤都多已发生不同程度的转移，手术难以根治，且术后常有复发。因此，卵巢癌被认为是预后最差的妇科恶性肿瘤之一。卵巢癌的肿瘤血管生成具有多样性［2］，存在血管生成(angiogenesis)、血管形成(vasculogenesis)和VM 3种方式。这些血管新生方式与肿瘤的转移、复发等恶性生物行为密切相关。VM是1999年Maniotis等［3］在研究高侵袭性葡萄膜黑色素瘤微循环时发现的一种独特的肿瘤血液供应方式，Folberg等［4］对VM定义为:由侵袭性肿瘤细胞而非内皮细胞连接、以细胞外基质成分为分隔而形成的微循环管道。随后，VM相继在卵巢癌、肝癌、前列腺癌以及横纹肌肉瘤［5－7］等高度恶性的肿瘤中被发现，且研究表明，VM的存在与侵袭性肿瘤的转移和预后不良密切相关［8］。VM管道直接由肿瘤细胞围成，肿瘤细胞与血流之间仅有一层PAS阳性的基底膜样物相隔，无血管内皮细胞屏障，因此肿瘤细胞释放的蛋白水解酶能够更容易地溶解基底膜样物而使肿瘤细胞直接进入血液，从而有利于肿瘤的侵袭和转移。也有学者对VM的存在持否定态度，他们认为VM是肿瘤组织内出血和坏死所致的假象，Shirakawa等［9］以充分的证据表明VM 是肿瘤组织内的一个功能性微循环，而并非出血坏死的肿瘤组织形成的腔隙，血管造影显示VM内有血流通过，从而证实VM为血管样结构，同时其研究发现，7.9%的人乳腺癌组织中存在VM现象，具有VM的患者更易发生血道转移而且生存期较短。Hoffmeyer等［10］认为，肿瘤细胞高表达E－cad和ras相似基因家族成员 A(ras homolog gene family，member A，RhoA)，且对于I型胶原有更强的亲合力，可能是炎性乳腺癌发生VM的机制之一。Sood等［11］发现在卵巢癌也存在VM现象，在含有基质胶(Matrigel)或I型胶原的三维培养体系中，高侵袭性卵巢癌细胞(SKOV3和EG)能形成VM管网状结构，其中缺乏内皮细胞或成纤维细胞，而低侵袭性卵巢癌细胞没有VM现象。赵秀兰等［6］通过对肝细胞肝癌中VM的研究发现，不同分化程度的肝癌中均可有VM的存在，但低分化者VM阳性率高于高分化者。Folberg等［12］认为，VM结构由于缺乏内皮细胞衬覆，管壁上的肿瘤细胞容易脱落进入管道中，进入血管向远处转移，因此与肿瘤的转移及不良预后密切相关。

本实验通过对80例卵巢EOC组织的检测，在46例病例中发现了符合VM标准的管道结构，证实了在EOC中确实有VM的存在。VM存在的区域很少出现坏死，且VM的检出率与肿瘤细胞分化程度、肿瘤转移与否及临床分期等密切相关。即伴有VM存在的EOC具有低分化、临床分期晚以及更容易发生转移等特点，这与上述国内外的文献报道基本一致。

钙黏蛋白是一组 Ca2+依赖性跨膜糖蛋白，E－cad是家族中的主要成员，其基因定位于16q22.1。E－cad普遍存在于各类上皮组织中，是上皮细胞的标志物，主要分布于同种上皮细胞侧面的黏附小带处，在极化上皮细胞之间的黏附起主要作用［13］。E－cad介导细胞间的黏附连接，在胚胎发育、形态学发生、细胞分化、上皮极性与完整性的维持方面起着重要作用，是重要的细胞 －细胞间粘附分子。E－cad异常表达是分子离散的基础，其表达的减少及确实与人类各种肿瘤侵润和转移的关系较为密切。Fujioka等［14］的研究表明，卵巢上皮性癌E－cad表达较正常卵巢表面上皮下降，高分化卵巢上皮性癌E－cad表达高于中、低分化癌(P＜0.05)，与原发灶相比，60%周围转移病变出现E－cad表达下降。Faleiro－Rodrigues等［15］指出卵巢肿瘤恶性程度越高，E－cad阳性表达率越低，E－cad表达与卵巢癌的FIGO分期(P＜0.05)、组织亚型(P＜0.01)、腹膜转移(P＜0.01)和残余病灶大小(P＜0.01)有关。

本研究结果显示E－cad的表达与EOC的分化程度、转移情况及临床分期等因素呈现相关性，即随着E－cad表达的降低，EOC出现分化降低、临床分期晚以及更容易发生转移的特点。并且本研究发现，在EOC中，随着E－cad表达率的降低，VM的阳性率显著升高，两者呈现负相关性(r=－0.578，P＜0.01)。这一结果提示在EOC的VM形成过程中，E－cad可能起到某种关键性作用。我们推测，随着E－cad表达的减少，不仅使细胞间附着变得松散，也使得细胞内骨架缺少相邻细胞因黏附而形成的固定作用，从而获得自身变形并形成细胞间腔隙的能力，从而促进VM的形成。

本研究多因素分析显示，VM、E－cad表达、PTNM分期和腹腔脏器及淋巴结转移是影响EOC患者的独立预后因素。进一步的生存分析提示VM阳性组比VM阴性组有更低的5年生存率，这与文献报道结果相同;此外，E－cad阳性组的5年生存率显著高于阴性组，提示E－cad的表达对于EOC患者的生存率及生存期预后的估计可能有一定的指导意义。

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