hPer3基因启动子甲基化检测在慢性粒细胞白血病急变监测中的临床意义*

李翊卫， 王晔恺， 周吉航， 周世权， 方国安， 刘晓光

(舟山医院1检验科，2细胞分子生物学实验室，浙江 舟山 316004)

慢性粒细胞性白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一种起源于骨髓多能干细胞的恶性增殖性疾病，起病隐匿，一旦急变，治疗困难，死亡率高［1，2］。因此，对 CML 急变的早期监测尤为重要。时钟基因在宏观上能作用于前下丘脑视上核影响生物钟变化［3］，在微观上对多种肿瘤细胞的增殖分化存在密切影响［4，5］。但时钟基因与白血病的报道不多，我们通过观察CML急变中时钟基因hPer3(human period 3)的表达和启动子甲基化水平变化，并将hPer3基因转染CML细胞株K562观察对其的抑制和促凋亡作用，以明确hPer3基因在CML急变中的作用及检测价值。

材料和方法

1 临床资料

收集我院2006年1月－2010年11月门诊和住院CML患者骨穿标本29例，抽取时间均为上午8:00 －10:00，瑞氏染色法镜检确定 FAB 分型［6］，CML慢性期17例，男10例，女7例，中位年龄43(39－57)岁，CML加速期6例，男4例，女2例，中位年龄46(37－53)岁，CML急变期6例，男5例，女1例，中位年龄49(37－62)岁，以良性血液病组40例(均为缺铁性贫血)为对照，样本抽取时间同上，男21例，女19例，中位年龄37(18－62)岁，良性血液病组骨穿检查均符合临床指征，采用肝素抗凝针筒留取2－4 mL骨髓，－80℃冰箱保存。

2 仪器和试剂

DNA纯化试剂盒和普通PCR扩增试剂盒购自Promega，对苯二酚、亚硫酸氢钠、氯仿、氢氧化钠购自上海晶纯试剂有限公司，DNA marker购自广州东盛生物科技有限公司，Trizol购自Invitrogen，CpG甲基转移酶(CpG methyltransferase，M.SssI)购自北京NEB，pMD18载体试剂盒和荧光定量 PCR试剂盒(SYBR Green I)购自TaKaRa，小牛血清和 RPMI－1640培养液购自碧云天，K562细胞株购自中科院上海细胞库。甲基化特异性－PCR引物:MSF正义链5'－ CGGGAGTTTTGGGTATTCGC － 3'，反义链 5'－CGACCCGACTAACTAAAACG－3'，甲基化产物 182 bp;USF正义链5'－TGGGTGGTTGGGTGGGAGTTTTGGGTATTTGT －3'，反义链 5'－AATCCAACACCAACAACCCAACTAACT AAAACA －3'，非甲基化产物207 bp;荧光定量 PCR引物:hPer3正义链 5'－ACAAACAGAACCACAAGGCA －3'，反义 链 5'－CGTCCATTTGTTGGCATTT －3'，扩增产物 94 bp;GAPDH正义链 5'－GACCTGACCTGCCGTCTA －3'，反义链 5'－ AGGAGTGGGTGTCGCTGT－3'，扩增产物148 bp;pcDNA3.1 －hPer3 PCR 引物:pcDNA3.1－hPer3正义链5'－CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGC CCCGCGGG-GAAGCTCC －3'，反义链 5'－CGGGCCCTCTAGACTC-GAGTTACG TTCGAACTTTATGCC－3';均由上海生工合成。hPer3质粒模板由舟山同生生物科技有限公司协助构建。凝胶成像系统为Bio－Rad公司Universal Hood II型，凝胶成像分析软件为Quantity One，普通 PCR 仪为 Roche Mycycle，荧光PCR仪为Roche Lightcycle。

3 方法

3.1 生物信息学分析 从MethDB数据库中选取hPer3启动子中富含CpG岛的－465～269位点区域利用ABI MethPrimer软件设计甲基化引物:MSF正义链(－453～444)，反义链(－281～301);非甲基化引物:USF正义链(－465～444)，反义链(－269～301)。

3.2 hPer3 mRNA 检测

3.3 hPer3基因启动子甲基化检测

为加强日常的运行与管理，保证工程的良性运行，避免因职能设置混乱、相互扯皮及人员分工的不合理造成不应有的经济损失而影响日常的正常通水要求，应建立健全各项规章制度、完善职能分工和搞好人员的优化配置。

①hPer3和GAPDH标准品构建 用Trizol提取骨髓总RNA，鉴定完整性和纯度，取5 μg总RNA冰上逆转录成cDNA进行逆转录PCR，反应体系25 μL:其中 DNA 模板 2 μL，10 μmol/L hPer3 或 GAPDH 荧光定量 PCR 引物各1 μL，5 ×PCR 缓冲液5 μL，加去RNA酶水补至25 μL，反应条件:95℃ 10 min;95℃20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环，72 ℃ 10 min。PCR反应产物经纯化后，加入连接缓冲液5 μL、纯化的目的片段4.5 μL、pMD18 －T 载体 0.5 μL，低速离心后于16℃连接过夜，将连接液转化大肠杆菌DH5α后涂氨苄青霉素平板，挑取单菌落培养过夜，抽提其质粒通过PCR鉴定阳性重组子，送上海生工公司测序确认。

②实时荧光定量PCR 将重组质粒倍比梯度稀释作为标准品，用①中的cDNA进行SYBR Green I荧光染料嵌合法检测，反应体系参照试剂说明书，反应条件:95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72℃ 10 min，利用各自的标准曲线分别对样品中目的基因和内参照基因分别进行定量，骨髓组织或白血病细胞株中hPer3基因mRNA的相对表达量为hPer3基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数。

归一化的效果是将原始数据映射到[0,1]区间,之后用训练集对SVM进行训练,最后用得到的模型来预测测试集分类标签.本文中选取能较好反映5种状态的18名被试的总共300组典型数据作为训练集,再选取另外的200组数据作为测试集.设置5种交互状态下类别标签分别为(0;1;2;3;4).

③结果判定 甲基化引物进行扩增有产物而非甲基化扩增无产物为完全甲基化，甲基化引物和非甲基化扩增都有产物为部分甲基化，甲基化引物进行扩增无产物而非甲基化扩增有产物为无甲基化。完全和部分甲基化判定为甲基化阳性，无甲基化为甲基化阴性。

①“村两委”成立公共卫生委员会，加强对村民“绿色生活”教育，提高村民环保意识。加强农村环境卫生综合治理，制定卫生公约，定期开展卫生检查和评定。对污染严重的乡村企业，由乡（镇）政府下达限期整改、取缔或关闭的通知。

②甲基化特异性PCR 以ddH2O为空白对照，用经M.SssI处理后的基因组DNA为阳性对照。反应体系25 μL，其中 DNA 模板 2 μL，10μmol/L 甲基化或非甲基化正反向引物各1 μL，5×PCR 缓冲液5 μL，加去离子水补至25 μL。95℃预变性15 min;94℃50 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35 个循环;72 ℃ 5 min，完成扩增反应，产物用2%的琼脂糖电泳，凝胶成像仪紫外灯下观察结果。

①组织DNA抽提和甲基化修饰 采用苯酚氯仿法抽提患者骨髓基因组DNA和细胞株基因组DNA，采用紫外分光光度计测量测定吸光度，确定其纯度。吸取4 μL基因组DNA至40 μL去离子水中，加10 μL 3 mol/L的氢氧化钠，37℃孵育20 min，加入30 μL 10 mmol/L 的对苯二酚和520 μL 1.5 mol/L 的亚硫酸氢钠，50℃孵育16 h，应用DNA纯化试剂盒纯化回收，加入50 μL 1 mol/L的氢氧化钠，室温放置5 min终止修饰，无水乙醇沉淀离心回收，室温干燥后加入20 μL去RNA酶水重悬，－20℃保存备用。

十几年后，在一个阴霾的秋日里，我跟一位司机开大卡车去给一个镇子拉活儿。那是一个弥望郁然、有山有水的镇子，镇子被一层薄薄的流雾缠绕着。

③MTT检测K562细胞抑制率 收集②中细胞，各孔吸出培养液，PBS洗1次，吸弃，加培养液180 μL，实验终止前加5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h;控干液体，每孔加DMSO 150 μL，96孔振荡板低速混匀10 min。酶标仪选择波长490 nm，测定各组各孔吸光度A值。生长抑制率(IR)计算公式:IR(%)=(1－实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

①pcDNA3.1－hPer3质粒构建 hPer3质粒模板PCR产物经胶回收后，重组克隆到pcDNA3.1质粒，并对pcDNA3.1－hPer3质粒进行测序确认。

②脂质体介导的质粒转染 pcDNA3.1－hPer3质粒参照试剂盒说明书经LipofectamineTM试剂盒转染到K562细胞，设空载pcDNA3.1转染组和空白对照组。转染后分别培养 24 h、48 h、72 h、96 h，每组设 6 复孔。

3.4 hPer3转染K562细胞株

④Annexin V－FITC/PI双染检测凋亡 收集②中细胞，预冷PBS洗涤弃上清，残渣细胞收集至流式管。每管加10 μL Annexin V －FITC 和5 μL PI，避光静置15 min，加300 μL预冷的PBS，振荡混匀上机检测其凋亡率。

4 统计学处理

3.2.3 严格执行消毒隔离 ①做好自我防护:戴手套操作;有创治疗时戴护目镜;严格执行六步洗手法。②做好锐器伤防范:注射车上放置剪刀并固定，以便在床旁及时处理一次性医疗废弃物;医师、护士、保洁工熟知锐器伤后的处理和上报流程;推广使用安全型留置静脉注射器，保护患者静脉、保证患者休息、减少锐器伤的发生。③所有操作严格均按标准预防技术操作原则进行。④教会患者家属处理污物的方法，如接触疑为血液、体液污染物品需戴手套给予处理并及时洗手，所有被体液污染物品按医疗废弃物处理，防止发生院内外交叉感染的可能。

采用SPSS 13.0软件，对 hPer3在 CML各阶段和对照组的甲基化分布两两进行χ2检验(对1≤T＜5且n≥40采用校正χ2检验)，对CML各阶段hPer3 mRNA表达做单因素方差分析和LSD－t检验，对K562转染后固定时点的pcDNA3.1组和pcDNA3.1－hPer3组抑制率做t检验，对K562转染后固定时点的对照组和 pcDNA3.1组、pcDNA3.1－hPer3组做单因素方差分析和LSD－t检验。

结 果

1 hPer3基因启动子在CML各阶段的甲基化分布

见图1，对照组、CML慢性期、CML加速期和CML急变期中，hPer3启动子甲基化阳性率(例)分别为0%(0/40)、17.65%(3/17)、66.67%(4/6)和83.33%(5/6)。CML急变期和加速期甲基化阳性率均高于 CML慢性期，差异显著(χ2=8.44，P ＜0.01;χ2=5.03，P ＜0.05)，但与 CML 急变期和加速期差异无显著(P＞0.05);CML急变期、加速期和慢性期甲基化阳性率均高于对照组，差异显著(χ2=29.29，P ＜0.01;χ2=21.41，P ＜0.01;χ2=4.33，P ＜0.05)。

Figure 1.hPer3 promoter methylation rates in IDA group and different phases of CML groups.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs IDA group;▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01 vs CML chronic phase group.图1 hPer3基因启动子在CML各阶段和IDA组中的甲基化分布

2 CML各阶段hPer3 mRNA表达

见图2，对照组、CML慢性期、CML加速期和CML急变期中hPer3 mRNA表达为75.03±18.16、5.13±2.29、0.40±0.18和0.17±0.05。各组两两之间差异显著(P＜0.01)。

3 K562细胞株hPer3启动子甲基化状态

见图2，K562细胞株中，hPer3启动子为完全甲基化状态，mRNA表达为0.05±0.03。

Figure 2.hPer3 promoter methylation status in K562 cells.M:methylation;U:unmethylation;m:marker;1:M.SssI;2:K562 cells;3:ddH2O.图2 K562细胞中hPer3启动子甲基化状态

4 hPer3转染K562细胞株

4.1 MTT检测K562细胞抑制率 见图3，24 h、48 h、72 h、96 h 各时点，pcDNA3.1 组抑制率分别为(1.3±0.3)%、(1.6±0.5)%、(1.3±0.5)%、(1.9±0.4)%;pcDNA3.1－hPer3组抑制率分别为(9.8±2.4)%、(29.1±5.1)%、(48.2±8.1)%、(63.4±10.5)%，各时点差异显著(P＜0.01)。

Figure 3.Inhibitory rates of K562 cells detected by MTT.＊＊P ＜0.01 vs pcDNA3.1 group.图3 MTT检测K562细胞抑制率

4.2 Annexin V－FITC/PI双染检测凋亡 图4、5结果显示，24 h、48 h、72 h、96 h 各时点，对照组凋亡率分别为(1.9±0.7)%、(2.6±0.8)%、(2.2±0.6)%、(2.8±0.9)%;pcDNA3.1组凋亡率分别为(2.4±0.8)%、(2.7±1.1)%、(2.5±1.1)%、(3.4±1.3)%;pcDNA3.1－hPer3组凋亡率分别为(7.4±2.3)%、(11.2±3.7)%、(16.9±4.5)%、(18.8±4.3)%。各时点pcDNA3.1－hPer3组凋亡率均高于对照组和pcDNA3.1组，差异显著(P＜0.01)。

In this paper,the discriminator of the DLL is defined as:

Figure 4.Apoptotic rates of K562 cells in control group，pcDNA3.1 group and pcDNA3.1 － hPer3 group.＊＊ P ＜0.01 vs pcDNA3.1 group or control group.图4 各组早期凋亡率

Figure 5.Apoptotic rates of K562 cells detected by AnnexinV/PI staining.图5 Annexin V－FITC/PI双染检测凋亡

讨 论

CML的发病率仅次于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，慢粒经加速期转入急变期过程中，约半数患者的转变是逐渐发生的，但也有部分患者转变迅速。国外有文献认为，CML患者长期的酪氨酸激酶抑制剂治疗引起CML患者骨髓白血病干细胞转变为具有额外特性的高级干细胞，这种高级干细胞引发了CML的急变并产生抗药等不良后果［1］。CML慢性期出现进行性贫血、发热持续不退、脾脏进行性肿大、出血倾向和骨骼疼痛、血象及骨髓象的改变等症状均预示有急变的可能。由于CML主要病因为BCR－ABL融合基因的产生，对CML缓解程度的分子生物学检测多以BCR－ABL转录本水平进行判断。但本研究显示，hPer3的表达水平也可能作为慢粒急变的监测指标之一，与Yang等［7］的研究结果基本一致。hPer3作为时钟基因的一种，正常体内虽存在一定程度的振荡，但在从CML慢性期进入加速期的变化幅度在1个数量级以上，远高于正常体内的振荡幅度［8］，可能作为慢粒急变的早期监测指标之一。

可见,带借代意义的词,之所以获得了借代意义,从源头上看,是由于人们在认知事物的过程中,不同的词涉及多个不同角度的关联性所使然。这种不同的角度在语言系统中又是相互依存、相互关联的,没有主次分别。不过,就其关联的事物的类别而言,同类关联和异类关联还是有着性质上的不同。也正因此,我们将这些不同的语义内在联系方式区分为同类理据和异类理据。从探求理据的角度看,同类理据要比异类理据相对容易一些。

真核细胞基因表达调控途径通常有转录水平调控、染色质结构调控、转录后水平调控、翻译水平的调控等，启动子区域甲基化属于转录水平调控的一种，如果CpG岛的甲基化为引起转录效率降低，那么其转录效率一般和甲基化程度存在相关性，如Na等［9］用甲基化特异性PCR和逆转录PCR观察45例非小细胞肺癌患者GADD45家族基因启动子甲基化和其 mRNA的关系，发现 GADD45A、GADD45B和GADD45G 分别有1.4%、7.2%和31.6%的甲基化比率，其中GADD45G mRNA降低与甲基化存在显著相关。本研究发现，hPer3启动子上的甲基化水平也随着CML急变而升高，但在急变期和加速期间差异无显著，可能和样本例数过少有关，并且在慢粒细胞株K562中也观察到了hPer3启动子的完全甲基化状态。因此CML中很可能是hPer3启动子高甲基化导致了其基因的表达降低，某些去甲基化制剂5－杂氮－2'－脱氧胞苷诱导 MEG－01凋亡［10］可能和恢复hPer3的表达有关。Yang等［7］通过5－杂氮 －2'－脱氧胞苷逆转了K562细胞中hPer3启动子的高甲基化状态并诱导hPer3基因重新表达，提示抑癌基因hPer3的激活可能是地西他滨治疗恶性血液疾病的机制之一。我们通过转染并在K562细胞中瞬时表达hPer3，发现K562呈现凋亡和生长抑制。有报道表明，hPer1参与了ATM－chk1/chk2的DNA损伤反应通路，并预示可能作为一种肿瘤抑制因子［11］，而孙成铭等［12］通过将hPer2转染到K562细胞中观察到cyclin B1的降低引起的 G2/M期阻滞［2］，这说明hPer3也可能通过类似机制作用于K562细胞，其表达缺失可能是慢粒表达的原因之一，但究竟hPer3的表达缺失是原发性还是继发性引起的，值得进一步研究。

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