晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮 -间叶转化

邵维斌,彭淑娟,夏春英,李 忻,荀 康

(江苏省镇江市第一人民医院肾脏内科,江苏镇江,212002)

腹膜纤维化和大量新生血管形成是导致长期腹膜透析患者腹膜功能衰竭的主要原因[1-2]。随着腹膜透析的进行,非生理性透析液尤其是晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)、葡萄糖降解产物等可引起腹膜间皮细胞逐渐丧失上皮细胞表型,如 E-钙粘蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白等表达下降,同时获得肌纤维母细胞样的特性,如 snail蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达上升,即发生上皮 -间叶转化[3-4],这种发生 EMT的腹膜间皮细胞具有浸润和迁移的能力,因而腹膜间皮细胞 EMT可能是导致腹膜纤维化和新生血管形成的关键环节[4-5],本研究建立了大鼠腹膜间皮细胞 EMT模型来探讨腹膜间皮细胞 EMT在腹膜透析时腹膜损伤过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 原代大鼠腹膜间皮细胞的培养

大鼠腹膜间皮细胞分离、培养及鉴定[6],取第 3代细胞进行实验。

1.2 分组

①对照组:正常的 M199培养基;② 40 mmol/L AGEs组:含 40 mmol/L AGEs-BSA(AGEs牛血清白蛋白,美国 Biovision公司)的M199培养基;③ 80 mmol/L AGEs组:含 80 mmol/L AGEs-BSA的 M199培养基;④牛血清白蛋白(BSA)组:含 80 mmol/L BSA的 M199培养基。第 3代大鼠腹膜间皮细胞经上述各组培养基培养 48、72 h后收集细胞,分别提取 RNA、蛋白。

1.3 实时定量 PCR检测 E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA的表达

细胞总 RNA抽提按 Trizol试剂盒的方法进行,运用实时定量 PCR试剂盒(德国 Qiagen公司)检测,反转录 50℃、20 min,E-cadherin引物序 列 :正 义链 5′-ACCCCTGTTGGTGTCTTT-3′,反义链 5′-TTCGGGCTTGTTGTCATTC T-3′。 α-SMA引物序列:正义链 5′-GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG-3′,反义链 5′-ACGA AGGAATAGCCACGCTCA-3′。 CollagenI引物序列 :正义链 5′-GGTAACGATGGTGCTGTCG G-3′,反义链 5′-GGGACCTTGAACTCCAGCAG-3′。TGF-β1引物序列:正义链 5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCC-3′, 反义链 5′-CTGTGCTATTGCCTTGTC-3′。 VEGF引物序列:正义链 5′-TTACTGCTGTACCTCCAC-3′, 反义链 5′-ACAGGACGGCTTGAAGATA-3′。 GAPDH引物序列:正义链 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′, 反义链 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。 HotStarTaq DNA多聚酶激活 95℃、15 min,E-cadherin反应条件:94℃变性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 45 s,35个连续循环;α-SMA反应条件:94℃变性 30 s,57℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,28个连续循环;CollagenI反应条件:94℃变性 30 s,57℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,29个连续循环。TGF-β1反应条件:94℃变性30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,35个连续循环。VEGF反应条件:94℃变性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,40个连续循环。得出 Ct值按公式 2-Ct求出基因表达的相对变化量[7],然后进行各组间比较。

1.4 Western blot法检测 E-cadherin、α-SMA蛋白的表达

裂解处理后的大鼠腹膜间皮细胞,4℃ 1 000 r/min离心 10 min后取裂解液上清测蛋白浓度,取细胞裂解蛋白(约 30μg)经 SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至 PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭 2 h,分别加入小鼠抗 E-cadherin抗体(美国 BD公司)、小鼠抗 α-SMA抗体(丹麦 Dako公司)和小鼠抗 β-actin抗体(美国 CST公司)4℃过夜,洗膜后加辣根过氧化酶标记的大鼠抗小鼠 IgG抗体(美国 CST公司),37℃、1.5 h,洗膜后加 ECL试剂,X线自显影显示结果,分析光带的吸光度。

1.5 ELISA法测定细胞培养液中 TGF-β1和VEGF

大鼠腹膜间皮细胞分组干预48 h和72 h后,离心收集细胞上清液,按 ELISA试剂盒说明检测TGF-β1和 VEGF蛋白水平。

1.6 统计方法

2 结 果

2.1 原代大鼠腹膜间皮细胞鉴定

腹膜间皮细胞呈圆形、椭圆形、多边形等,融合后呈典型的铺路石样。免疫组化结果示细胞角蛋白(cytokeratin)、波形蛋白(vimentin)阳性。

2.2 AGEs刺激大鼠腹膜间皮细胞引起细胞形态学变化

正常大鼠腹膜间皮细胞呈铺路石状,在AGEs作用 48 h后大鼠腹膜间皮细胞失去原来的整齐排列,细胞逐渐拉长,作用 72 h后细胞出现明显的梭形或不规则形改变,似成纤维细胞,部分细胞出现互相交叉重叠现象。

2.3 AGEs对大鼠腹膜间皮细胞 E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表达的影响

实时定量 PCR检测结果显示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后, α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表达水平随时间延长逐渐增加(图 1-4),而 E-cadherin mRNA表达水平随时间延长逐渐下降(图 5)。与对照组及 BSA组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组间皮细胞 α-SMA mRNA的相对表达量

图2 各组间皮细胞 Collagen I m RNA的相对表达量

图3 各组间皮细胞 TGF-β1 mRNA的相对表达量

图4 各组间皮细胞 VEGF m RNA的相对表达量

图5 各组间皮细胞 E-cadherin m RNA的相对表达量

2.4 AGEs对大鼠腹膜间皮细胞 E-cadherin、α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表达的影响

Western blot结果显示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后,α-SMA蛋白表达水平随时间延长逐渐增加(图 6),而 E-cadherin蛋白表达水平随时间延长逐渐下降(图 7)。与对照组及BSA组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。

ELISA结果显示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后,TGF-β、VEGF蛋白表达水平随时间延长逐渐增加(图 8-9),与对照组及BSA组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。

图6 各组间皮细胞 α-SMA蛋白的相对表达量

图7 各组间皮细胞 E-cadherin蛋白的相对表达量

图8 各组间皮细胞 TGF-β1蛋白的表达水平

图9 各组间皮细胞 VEGF蛋白的表达水平

3 讨 论

腹膜透析(peritoneal dialysis)已进入临床 30余年,随着其装置的不断改进,在我国越来越多慢性肾衰患者开始肾替代治疗时首选腹膜透析疗法。然而随着腹膜透析时间延长,由于反复发作的腹膜炎、机体的炎症状态以及非生理性透析液尤其是高浓度葡萄糖、葡萄糖降解产物、AGEs等可引起腹膜结构改变和腹膜功能衰竭,临床上出现超滤失败[8]。这是患者退出腹膜透析的主要原因之一,同时也制约了腹膜透析的应用和发展[9]。长期腹膜透析患者腹膜出现表层间皮细胞消失、大量新生血管形成及透明样血管病变、纤维化等病理改变,腹膜纤维化和大量新生血管形成是导致腹膜功能衰竭的主要原因。但目前对于导致腹膜纤维化和新生血管形成的机制尚不完全清楚。因此探讨腹膜纤维化和新生血管形成的机制,并寻求有效的防治方法,具有重要的临床意义。正常人的腹膜或非腹膜透析肾衰竭患者的腹膜中并不存在肌成纤维细胞[10]。近年来,越来越多的证据表明[2,10],腹膜透析患者腹膜组织中肌纤维母细胞明显增多,肌成纤维细胞的特性是具有合成细胞外基质、细胞因子、生长因子及参与炎症反应的能力,并具有收缩功能,还可表达平滑肌肌动蛋白,兼有纤维细胞及平滑肌细胞两者的特性,在各种修复及纤维化过程中,肌成纤维细胞起重要作用。过去认为其主要来源于腹膜组织中活化的成纤维细胞;然而最近的研究发现[2-4,11-12]:随着腹膜透析的进行,腹膜透析患者腹膜间皮细胞逐渐丧失上皮细胞表型,同时获得肌纤维母细胞样的特性,即发生 EMT。研究证明 EMT在肾、肝、肺等器官纤维化中有重要的作用[13-15]。因而有学者推测发生 EMT的腹膜间皮细胞可能是腹膜透析患者腹膜组织中肌纤维母细胞的主要来源之一[4]。但腹膜间皮细胞 EMT在腹膜纤维化和新生血管形成中的作用及机制目前尚不完全清楚。

作者先前的研究表明:高浓度葡萄糖能诱导大鼠腹膜间皮细胞 EMT[16],在本研究中我们探讨了 AGEs对大鼠腹膜间皮细胞 EMT的影响。我们体外研究发现:AGEs不仅能引起大鼠腹膜间皮细胞形态改变(由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞),而且晚期糖基化终产物还能上调大鼠腹膜间皮细胞 α-SMA、Collagen I mRNA和 α-SMA蛋白表达水平和下调大鼠腹膜间皮细胞 E-cadherin mRNA和蛋白表达水平,表明 AGEs诱导了大鼠腹膜间皮细胞 EMT;同时我们发现 AGEs能上调大鼠腹膜间皮细胞 TGF-β、VEGF mRNA和蛋白表达水平,而 TGF-β、VEGF在腹膜透析时腹膜纤维化和腹膜新生血管形成过程中起重要作用。我们研究结果为进一步探讨腹膜间皮细胞 EMT在腹膜纤维化和新生血管形成中的作用及机制提供了体外模型及实验基础。

[1] Mateijsen MA,van der Wal AC,Hendriks PM,et al.Vascular and interstitial changes in the peritoneum of CAPD patients with peritoneal sclerosis[J].Perit Dial Int,1999,19(6):517.

[2] Devuyst O,Margetts PJ,Topley N.The pathophysiology of the peritoneal membrane[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(7):1077.

[3] Vargha R,Endemann M,Kratochwill K.Ex vivo reversal of in vivotransdifferentiation in mesothelial cells grown from peritoneal dialysate effluents[J].Nephrol Dial Transplant,2006,21(10):2943.

[4] Aroeira L S,Aguilera A,Sánchez-Tomero J A,et al.Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients:pathologic significance and potential terapeutic interventions[J].JAm Soc Nephrol,2007,18(7):2004.

[5] Yanez-Mo M,Lara-Pezzi E,Selgas R,et al.Peritoneal dialysis and epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells[J].N Engl J Med,2003,348(5):403.

[6] 邵维斌,钱家麒.从网膜组织法培养人腹膜间皮细胞[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2001,10(1):92.

[7] Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method[J].Methods,2001,25(4):402.

[8] Brimble K S,Walker M,Margetts P J,et al.Meta-Analysis:peritoneal membrane transport,mortality,and technique failure in peritoneal dialysis[J].J Am Soc Nephrol,2006,17(9):2591.

[9] Gokal R.Peritoneal dialysis in the 21st century:an analysis of current problems and future developments[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(Suppl 1):S104.

[10] Jimenez-Heffernan JA,Aguilera A,Aroeira L S,et al.Immunohistochemical characterization of fibroblast subpopulations in normal peritoneal tissue and in peritoneal dialysisinduced fibrosis[J].Virchows Arch,2004,444(3):247.

[11] Aroeira L S,Aguilera A,Selgas R,et al.Mesenchymal conversion of mesothelial cells as a mechanism responsible for high solute transport rate in peritoneal dialysis:Roleof vascular endothelial growth factor[J].Am J Kidney Dis,2005,46(5):938.

[12] Kim Y L.Update on mechanisms of ultrafiltration failure[J].Perit Dial Int,2009,29(Suppl 2):S123.

[13] Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(2):212.

[14] Rippe B.Peritoneal angiogenesis in response to dialysis fluid[J].Hepatology,2009,50(6):2007.

[15] Corvol H,Flamein F,Epaud R,et al.Lung alveolar epithelium and interstitial lung disease[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(8-9):1643.

[16] 邵维斌,荀 康,李 忻,等.高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮 -间叶转化[J].实用临床医药杂志,2010,14(17):4.