血小板源性生长因子 -DD通过 Akt信号通路促进膀胱癌 T24细胞增殖

卜 强,汤华明,谈 健,胡 潇,王东文

(1.山西医科大学第一临床医学院泌尿外科,山西太原,030001;2.江苏大学附属人民医院 泌尿外科,江苏镇江,212001)

血小板源性生长因子 -D(Platelet-derived growth factor,PDGF-D)是新近发现的 PDGF家族的新成员,特异性结合并激活二聚体受体PDGFRβ[1],从而发挥其生物学活性。目前发现PDGF-D参与胚胎的发育成熟、调节细胞增殖、凋亡、转化、迁移、侵袭、血管生成等多种生物学活性,在肿瘤方面的研究已涉及前列腺癌、肾癌、肺癌、卵巢癌等[2-4],因而成为生长因子家族的一个研究热点,有研究发现,PDGF-D在膀胱移行细胞癌(BTCC)中高表达,与膀胱癌的发生和发展密切相关[5],然而,关于 PDGF-D对膀胱癌细胞增殖及相关机制的研究尚未见报道。PI3K/Akt信号通路在肿瘤的发生发展过程中起着重要的调节作用,包括转录、翻译、代谢、血管新生以及细胞周期和凋亡的调控[6],信号通路的激活常发生在恶变早期和肿瘤进展期,同时,信号通路激活程度也是肿瘤患者预后的重要指标。因此,本研究选择膀胱癌细胞株 T24,观测外源性 PDGF-DD对其增殖及信号转导通路的影响,阐述 PDGF-DD诱导膀胱癌细胞增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌细胞 T24(上海拜力生物技术有限公司),小牛血清(杭州四季青公司),DMEM培养液(Gibco公司),PDGF-DD为美国 Peprotech公司产品,MTT、LY294002、PDTC、雷帕霉素(Sigma公司)。兔抗人 NF-κB p65多克隆抗体(Santa Cruz公司 ),兔抗人 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗体(Cell Signaling公司),羊抗兔 IgG(中杉公司)。酶标仪(Bio-Rad公司),流式细胞分选仪(FACSAria,BD公司)。其余试剂均为进口或国产优级试剂。

1.2 细胞培养

人膀胱癌细胞 T24用含有 10%小牛血清的DMEM培养液,在 37℃、5%CO2且饱和湿度条件下培养,隔天换液,待细胞生长至约 80%融合时,用 0.25%胰酶和 0.02%EDTA的混合消化液分散成单细胞,传代培养,取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期的细胞,用上述消化液消化后制成单细胞悬液,计数,用 10%血清的 DMEM培养液将细胞密度调整为 2.5×103/孔,接种于 96孔培养板上,置于 37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜后,换为无血清培养条件培养 24 h,之后分别加入终浓度为 (1、5、10、20、50、100 ng/mL)的 PDGF-DD蛋白,5%血清的培养液作为阳性对照,无血清培养液作为阴性对照,各组设 3个复孔。继续培养 48 h后,各孔加入 5 mg/mL的 MTT 20μL,继续培养 4 h,吸除孔内液体,各孔加入150μL DMSO,震荡 10 min后,490 nm波长处测吸光度(A)值,实验重复 3次。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期

将 T24细胞接种在 6孔板内,待细胞铺满板底达 60%时,设置对照组,分别加入不同浓度的PDGF-DD(1、5、10、20、50、100 ng/mL), 培养 24 h后,收集细胞,用 PBS洗涤 2次,1 000 r/min,离心 5 min。加入 4℃预冷的 70%乙醇重悬固定,4℃过夜。1 500 r/min离心 10 min,去除乙醇。PBS洗涤 2次,1 000 r/min,离心 5 min,弃上清,用 1 mL PBS重悬细胞,加入 800μg/mL的RNase A 12.5μL,于 37℃水浴 30 min,加 1 mg/mL的碘化丙啶(PI)10μL混匀,4℃避光染 40 min,400目筛网过滤后,进行流式细胞仪检测。

1.5 western blot检测

将膀胱癌细胞接种到 6孔板中,不同浓度的PDGF-DD蛋白及各种抑制剂干预细胞后,常规提取细胞蛋白,以 10%SDS-PAGE电泳分离,4℃,90mA恒流转膜过夜。结束后,取出 PVDF膜在 5%脱脂牛奶中室温封闭 1 h。将膜以适量的一抗稀释液 (Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR按 1:1000,NF-κB56抗体按 1∶500;GAPDH按 1∶1 000稀释作为内参),室温下摇床孵育 2 h,以HRP标记的 IgG(1∶5 000)稀释液,同条件孵育 1 h,每次孵育后用 TBS-T漂洗 3次,每次 10 min。用 ECL发光剂显示阳性条带,并使用 GE公司的Typhoon 9400分子成像系统检测和分析结果。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 PDGF-DD对 T24细胞增殖的影响

外源性 PDGF-DD蛋白在无血清培养条件下作用膀胱癌细胞 48 h后,采用 MTT法检测细胞增殖,图 1所示,不同浓度的 PDGF-DD对细胞的生长均具有促进作用,当浓度≤20 ng/mL时,随着浓度的增加,促生长作用也增加,而浓度大于 20 ng/mL时,刺激细胞生长的作用开始下降。与对照组相比(细胞生长率为 100%),差异均有统计学意义,除 20 ng/mL与 50 ng/mL浓度之间外,各相邻浓度之间差异亦有统计学意义(P<0.05)。

图1 PDGF-DD对膀胱癌细胞 T 24增殖的影响

2.2 PDGF-DD对膀胱癌细胞周期的影响

T24细胞经 PDGF-DD作用 24h后,采用流式细胞仪检测不同浓度的 PDGF-DD对细胞周期的影响,与无血清培养组相比,各浓度组 DNA合成前期(G0/G1期)的细胞比例下降,DNA合成期(S期)细胞比例上升,对细胞周期的影响具有浓度依赖性,当 PDGF-DD≥20 ng/mL时,随浓度的增加,对细胞周期的影响开始下降,5～100 ng/mL组与无血清培养组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),表 1。

表 1 PDGF-DD对 T 24细胞周期的影响

2.3 PDGF-DD抑制 Akt信号通路蛋白的表达

在无血清培养的条件下,选择 10、20、50 ng/mL的 PDGF-DD处理细胞 24 h后,免疫印迹检测蛋白的表达,印迹条带上方数字为相对于对照组的灰度均值,T24细胞中 Akt、mTOR表达变化不明显,而 p-Akt、p-mTOR及核蛋白 NF-κBp65的表达均明显上调,并且具有浓度依赖性,PDGF-DD浓度为 20 ng/mL时表达最高,与对照组相比,p-Akt、p-mTOR和 NF-κBp65的表达水平分别增加 2.3、2.4、2.8倍(图 2)。

图2 免疫印迹检测 Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR以及 NF-κBp 65的表达

2.4 抑制剂对信号通路蛋白表达的影响

含 5%血清培养的 T24细胞,在 PI3K抑制剂LY294002(20μmol/L)、NF-κB抑制剂 PDTC(20μmol/L)和 mTOR抑制剂雷帕霉素 (100 nmol/L)独立或联合作用 8 h,免疫印迹结果显示,LY294002通过抑制 PI3K而降低 Akt及其下游蛋白的磷酸化,而 PDTC抑制 NF-κBp65的表达,对 p-mTOR的表达没有明显的影响,相反,雷帕霉素只抑制 mTOR磷酸化,对 NF-κBp65没有明显的影响。PDTC与雷帕霉素联合作用可以抑制 mTOR和 NF-κB通路,表明 mTOR和 NF-κB是/Akt通路的下游靶位,而这两条通路互为独立。PDGF-DD对细胞的调节可能是通过Akt/mTOR和 Akt/NF-κB两条独立的通路实现的。

图3 免疫印迹检测各种抑制剂对 T 24细胞 p-Akt、p-mTOR以及 NF-κBp 65蛋白表达的影响

3 讨 论

血小板源性生长因子(PDGF)是由多种细胞分泌的一种细胞因子,正常组织内 PDGF的分泌受到严格的调控,表达水平很低甚至完全检测不到,PDGF-D是 PDGF家族中新发现的成员,PDGF-D已经被证实在多种肿瘤高表达,表达增强与肿瘤的分化程度及转移密切相关,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。PDGF-D通过特异性地与 PDGFRβ受体结合,激活下游的信号通路 ,如 PI3K/Akt、MAPK/ERK[7]等 ,对肿瘤细胞的生物学活性起调节作用。有研究表明用小分子干扰 RNA下调 PDGF-D的表达,通过使 Notch-1和 NF-κB信号通路失活而抑制细胞生长和血管生成,减少了肿瘤细胞的侵袭力,反之用 cDNA转染技术上调 PDGF-D的表达增加了肿瘤细胞增殖和侵袭力,而且转染 PDGF-DsiRNA的细胞VEGF表达水平下降[8]。目前,越来越多证据表明 PDGF家族新成员 PDGF-D在促进肿瘤细胞生长,侵袭和血管生成中起着重要作用,然而,系统地研究其促细胞增殖及机制的报道尚少。本研究将外源性 PDGF-D作用膀胱癌细胞 T24,采用 MTT法和流式细胞仪检测其对细胞增殖及周期的影响。

本研究结果显示,外源性 PDGF-DD蛋白使膀胱癌细胞 T24活性增加,呈浓度依赖性,与无血清培养的对照组相比,均具有统计学意义(图 1)。并且浓度为 20 ng/mL时,对细胞的刺激作用最强,相对于 5%血清培养组,刺激作用较弱。不同浓度的 PDGF-DD均可使细胞周期各时相分布发生变化,G0/G1期细胞数减少,S期细胞数增加,对其影响亦具有浓度依赖性。

PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一,通过影响下游多种效应分子的活化调节细胞的基本功能,包括生存、生长、增殖和代谢,与肿瘤的发生和发展密切相关。因此抑制该信号通路成为肿瘤预防和肿瘤靶向治疗的热点。PDGF-D通过其受体活化 Akt,进而激活下游的mTOR,mTOR是 Akt的重要底物之一[9]。Akt通过直接和间接两种途径激活 mTOR,活化的mTOR可以引起肿瘤细胞的快速增殖、癌蛋白分泌增加、肿瘤周期加快、G1期时程缩短,促进肿瘤的发生发展。然而,这条信号通路并非线性存在,而同时存在着数种串话(crosstalk)和反馈调节机制。活化的 Akt可以通过 IKK-α及其他方式活化 NF-κB,NF-κB作为多种信号转导途径的汇聚点,其激活参与炎症、细胞增殖、细胞凋亡等多种基因的表达调控。为了进一步研究其促进细胞增殖的机制,我们利用 PI3K/Akt及其下游靶位蛋白的抑制剂独立或联合作用细胞,检测 Akt,mTOR及其磷酸化水平和 NF-κBp65表达的变化。结果表明,PDGF-DD通过 PI3K/Akt信号通路 ,增加 p-Akt、p-mTOR、NF-κBp65蛋白的表达,LY294002抑制 p-Akt及下游靶位蛋白的表达,而 PDTC抑制 NF-κBp65的表达,对 mTOR没有明显的影响,与 PDTC类似,雷帕霉素只抑制mTOR的磷酸化,PDTC与雷帕霉素联合作用可以抑制 mTOR和 NF-κB通路,说明,PDGF-DD活化 PI3K/Akt信号通路后,主要通过 mTOR和NF-κB两条独立的通路实现对细胞的生物学活性的调节。

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