三氧化二砷对 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞株抗增殖及诱导凋亡作用的研究

朱慕云,姜正华,葛 辉,李 梅,胡茂志

(1.扬州大学临床医学院呼吸科;2.扬州大学实验中心,江苏扬州,225001)

三氧化二砷(As2O3)是一种有毒的化合物,但低剂量 As2O3除作为一种有效的中药治疗牛皮癣、梅毒和类风湿性关节炎等多种疾病外,近年来的研究表明三氧化二砷具有抗肿瘤作用。本研究探讨了三氧化二砷对 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞株的生长抑制及诱导肿瘤细胞凋亡的作用,现报道如下。

1 材料与方法

三氧化二砷制剂(伊泰达),由哈尔滨伊达药业提供;二甲基亚砜(DMSO)和四甲基偶氮唑盐(MTT)购于上海华美公司;SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞株、RPMI-1640培养基及胰蛋白酶购于中国科学院上海生物细胞研究所;Annexin V:FITC Apoptosis detection kit及 FACSAria流式细胞仪:均为美国 Beeton Dickinson公司。

细胞培养:将 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞株培养于 37℃含 5%CO2温箱内,使用 RPMI-1640培养液(含 15%小牛血清,青链霉素各 100 U/mL,L-谷氨酰胺200mg/L)培养,肺癌细胞呈贴壁生长,2～3 d后用 0.25%胰蛋白酶消化传代。

实验分组:实验共设 3组,分别为空白组(加培养基 200μL),对照组(单细胞悬液 100μL+培养基 100μL,实验组(单细胞悬液100μL+处理因素 100μL)。

癌细胞生长抑制率的测定:将消化计数的单细胞悬液加入 96孔培养板中,调节细胞浓度为 1×105个/mL,采用MTT法,每孔加入单细胞悬液100μL,三氧化二砷制剂 100μL,浓度分别为每毫升 0.1 μg、0.4 μg、0.8 μg、1 μg、4 μg及 8μg,置 37℃、5%CO2培养箱中培养 24 h后,每孔加入 40μL MTT液(5 mg/mL),继续培养 4 h后,吸取上清液。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL/孔,振荡 10 min,使 MTT还原产物完全溶解,用ClinBio120型酶标仪,测定每孔光密度值(A570)。肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1-实验组 A值/对照组 A值)×100%

细胞凋亡的形态学变化:将消化计数的单细胞悬液加入 96孔培养板中,调节细胞浓度为 1×105个 /mL,每孔加入单细胞悬液 100μL和 1μg浓度的三氧化二砷制剂 100μL。分别在 12、24及 48 h后在倒置显微镜下观察细胞形态及细胞数的改变。

细胞凋亡的检测(Annexin V/PI标记法):将培养至对数生长的 SPCA/Ⅰ细胞装入 96孔板,调节细胞浓度为 1×105个/孔。隔夜培养后,分别加入终浓度为 0.4、4μg/mL的三氧化二砷制剂。再培养 24 h后收集细胞,离心机 1 500 r/min,离心 5 min并给予冷 PBS洗涤,用 Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I进行标记后,避光染色15 min,上流式细胞仪检测分析。

2 结 果

2.1 三氧化二砷对 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞有直接的抗增殖效应

将不同浓度的三氧化二砷(分别为 0.1、0.4、0.8、1.0、4.0和 8.0 μg/mL)作用于 SPCA/Ⅰ细胞 24 h后,进行 SPCA/Ⅰ细胞增殖抑制率的中位值检测,结果分别为:6.78%、16.34%、37.13%、56.26%、70.32%和 97.55%。见图 1。

2.2 细胞凋亡的形态学变化

图1 不同浓度的三氧化二砷对人肺癌细胞生长的抑制作用

将 1μg/mL的 As2O3作用于 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞,分别在作用 12、24和 48 h后经倒置显微镜观察并摄像,与对照组比较,细胞出现明显的形态学变化,表现为细胞胞浆固化,细胞核不规则,染色质浓缩;体积缩小变圆,部分核碎裂,胞质和细胞膜分离,出现空泡,细胞裂解等细胞凋亡的特征性改变,并与所作用的时间成正比。

2.3 三氧化二砷对 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞诱导凋亡的作用

采用Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I进行标记、流式细胞仪检测分析法,将 0.4μg/mL和 4μg/mL浓度的三氧化二砷作用于 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞 24 h后,计算出凋亡阳性细胞百分率分别为 17.8%和 28.6%,与对照组相比(3.3%)有显著差异(P<0.01)。表明三氧化二砷有诱导 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞凋亡的作用(图 2)。

结果判定:在双变量流式细胞仪的散点图 Q1-Q4象限上,Q3显示活细胞(Annexin V-/PI-),Q2象限显示非活细胞(Annexin V+/PI+),即凋亡晚期继发死亡细胞或坏死细胞,右下象限显示为凋亡细胞(Annexin V+/PI-)。

3 讨 论

凋亡是机体消除多余或有潜在危险细胞的生理现象,以维持机体细胞总数在适当的生理范围内。肿瘤不仅是细胞增殖、分化异常的结果,同时还是一种细胞凋亡调控障碍的疾病。凋亡受阻将导致细胞代谢的紊乱及肿瘤的发生和发展,是恶性肿瘤发生发展中的一个重要因素[1]。恶性肿瘤细胞凋亡的比例明显下降,如能诱导肿瘤细胞凋亡比例的增加,则有可能抑制恶性肿瘤的发生和发展[2-3]。

图2 AnexinV:PI标记检测三氧化二砷(0.4、4.0μg/mL)对SPCA-1人肺腺癌细胞凋亡的影响

三氧化二砷(As2O3)是一种砷化物,俗称砒霜,是一种有毒的化合物。但是,小剂量 As2O3具有抗癌活性,临床治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)已有近 40年历史,且已被美国食品和药物管理局批准用于治疗全反式维甲酸(ATRA)耐药的 APL。近年来应用 As2O3治疗人类肿瘤性疾病已成为肿瘤治疗领域的一大研究热点,国内外的一些研究显示,三氧化二砷对胃癌、结肠癌细胞、膀胱癌及喉癌等实体瘤[3-6]也有一定的疗效。三氧化二砷抗肿瘤作用的机理,目前认为可能有以下几个方面:细胞毒作用,诱导肿瘤细胞凋亡,调节肿瘤细胞增殖周期,影响肿瘤血管生成,逆转癌症细胞耐药等[6-8]。

本研究初步探讨了 As2O3对 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞抗增殖效应和诱导凋亡的效应,并分析了不同时间及不同浓度组 As2O3的作用。结果表明:不同浓度组的三氧化二砷对 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞的生长均有一定的抑制作用,其抑制程度和药物浓度呈正相关。通过倒置相差显微镜发现癌细胞产生了细胞胞浆固化,细胞核不规则,染色质浓缩;体积缩小变圆,部分核碎裂,胞质和细胞膜分离,细胞裂解等细胞凋亡的特征性改变。通过 Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I进行标记、流式细胞仪检测分析,在双变量流式细胞仪的散点图上发现不同浓度组的三氧化二砷对 SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞均有诱导凋亡的作用,并随着药物浓度的增加,凋亡率也相应增加。

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