肺癌中EGFR、VEGF与NET-1的表达及与临床病理因素的关系

卞伟钢,胡 平,宋 曙,何 啸,王传斌,陈 萍,陈 莉

(1.江苏省盐城市第一人民医院,江苏盐城,224005;2.江苏省南通大学医学院病理教研室,江苏南通,226001)

肺癌的发生是多因素综合作用的结果,在其生长过程中,肿瘤细胞的增殖和血管的新生起着基础而重要的作用。表皮生长因子受体(EGFR)广泛存在于哺乳动物的细胞膜上,参与细胞的恶性转化和增殖,血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的重要促进因子。NET-1是肿瘤增殖相关蛋白,在细胞信号转导、调节、黏附、移动、增生和分化中起重要作用。

1 临床资料

收集2004年1月至2006年12月盐城市第一人民医院、肿瘤医院、第三人民医院手术切除的原发性肺癌组织标本120例。全部病例均行常规病理检查,明确诊断与临床分期。120例标本中男性84例,女性36例,男女比例为1∶0.43;年龄34～78岁,中位年龄60岁,<60岁者51例,>60岁者69例。全部患者术前均未接受过化疗及放疗。取10例肺癌周边相对正常的肺组织作为对照组,所有组织均用10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,连续切片,作苏木精-伊红(HE)及免疫组化染色。

鼠抗人单克隆抗体EGFR、兔抗人多克隆抗体VEGF、SP免疫组化检测试剂盒购自福州迈新生物技术公司。兔抗人多克隆抗体NET-1由南通大学医学院病理教研室陈莉教授惠赠,美国旧金山基因生物公司协助合成。

常规脱蜡水化,组织抗原微波修复,10%山羊血清封闭。EGFR、VEGF抗体的工作浓度为1∶50,NET-1抗体的工作浓度为1∶20,免疫组化染色SP法按说明书操作步骤进行,DABH2O2显微镜控制下显色,苏木精复染,常规脱水中性树胶封片。使用PBS代替一抗处理的切片作为阴性对照,已知阳性组织切片作为阳性对照。

EGFR的阳性染色定位于肿瘤细胞的胞质或胞膜上、个别位于胞核上呈棕黄色颗粒,VEGF阳性表达定位于肿瘤细胞质内,呈棕黄色或褐色颗粒。光镜下选择5个表达EGFR、VEGF相对较多的区域,在高倍镜视野下每个视野分别计数200个细胞,共计1 000个细胞,按阳性细胞数占肿瘤细胞的比例进行分级:阴性(-)为无棕黄色染色或染色阳性肿瘤细胞数<10%;弱阳性(+)为阳性细胞数10%～25%;中等阳性( )为阳性细胞数25%～50%;强阳性( )为阳性细胞数≥50%。NET-1阳性染色定位于肿瘤细胞的胞质或胞膜上,呈棕黄色颗粒。阳性细胞数<5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。染色强度呈淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。阳性细胞百分比和染色强度两项积分相乘,0分为(-),1～4分为(+),5～8分为( ),9～12分为( )[1]。

2 结 果

2.1 对照组与肺癌组EGFR、VEGF、NET-1表达情况的比较

EGFR阳性表达于肺癌细胞的胞质或核膜上(图1-2),VEGF阳性表达于细胞质内(图3),NET-1阳性表达于肺癌细胞的胞质或胞膜上(图4)。120例肺癌组织中,EGFR、VEGF、NET-1阳性率分别为 69.16%(83/120)、55.83%(67/120)、85.00%(102/120);对照组10例正常组织中阳性率分别为10.00%(1/10)、0.00%(0/10)、40.00%(4/10)。肺癌组与对照组之间EGFR、VEGF、NET-1的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 EGFR、VEGF、NET-1在肺癌组与对照组中表达的比较

2.2 肺癌组织中EGFR、VEGF、NET-1的表达与临床病理因素的关系

肺癌组织中 EGFR、VEGF、NET-1的表达与肿瘤的临床分期、分化程度及有无淋巴结转移有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、病变部位无显著相关(P>0.05,表2)。

2.3 肺癌组织中EGFR、VEGF、NET-1三者表达的相互关系

120例肺癌组织中 EGFR、VEGF同为阳性表达者52例,同为阴性表达者22例,两者的表达有相关性(χ2=4.1773,P=0.041),且呈正相关(r=0.2056,P=0.0243,表3)。

120例肺癌组织中NET-1、VEGF同为强阳性表达者27例,同为阴性表达者11例,两者的表达有相关性(χ2=63.4132,P=0.000),且呈正相关(r=0.5547,P=0.000,表4)。

120例肺癌组织中NET-1、EGFR同为强阳性表达者20例,同为阴性表达者11例,两者的表达有相关性(χ2=51.8097,P=0.000),且呈正相关(r=0.6107,P=0.000,表5)。

表2 EGFR、VEGF、NET-1的表达与肺癌临床病理因素的关系

表3 EGFR、VEGF在肺癌组织中表达的相互关系

表4 NET-1、VEGF在肺癌组织中表达的相互关系

表5 NET-1、EGFR在肺癌组织中表达的相互关系

3 讨 论

图1 低分化腺癌EGFR阳性高表达 (SP 400倍)

图2 高分化鳞癌EGFR阳性高表达 (SP 400倍)

图3 低分化鳞癌VEGF阳性高表达 (SP 400倍)

已有研究发现[2-3],在多种肿瘤组织中存在EGFR的高表达。本研究发现,肺癌组织中EGFR蛋白的表达较正常组织明显升高,且其表达强度与-肿瘤组织的分化程度、临床分期及是否有淋巴结转移密切相关,与文献报道一致[4]。由于EGFR酪氨酸激酶是细胞信号传导的必要条件,因此我们认为在肺癌组织中EGFR与其配体结合后使得酪氨酸激酶磷酸化而激活了酪氨酸激酶,通过催化与肌醇磷脂代谢有关的酶、激酶,调节蛋白磷酸化,促进产生第二信使,导致核内原癌基因c-myc、c-fos表达,刺激了肺癌细胞发生增殖,与肺癌的恶性进展密切相关。

实体肿瘤生长的两个关键过程是肿瘤细胞的增殖和血管生成,目前已知在所有的已知实体肿瘤中均存在VEGF表达的上调[5-6]。本研究显示,肺癌组织中VEGF蛋白的表达较正常组织明显升高,且与肿瘤组织的分化程度、临床分期及是否有淋巴结转移密切相关,这是由于VEGF一方面可以通过激活Akt通路来增强肿瘤细胞对凋亡的阻抗[7],另一方面可通过与其受体结合,诱导肿瘤内新的血管及淋巴管生成,促进肿瘤细胞的增殖和淋巴道转移,导致了肺癌的恶性病程及淋巴结转移。

四聚体超家族(TM4SF)是一组含有4个疏水性跨膜结构域的蛋白,在细胞外形成两个大小不等的环状结构,氨基端和羧基端位于胞质内,长度较短。这些分子之间有很多高度保守的序列,并且大多数同源性序列都位于跨膜区域[8]。从1990年发现至今,TM4SF的成员已发展到了25个,NET-1基因是TM4SF家族成员之一,定位于1p34.1,其mRNA全长为1 297 bp,编码序列为128～853 bp,有241个氨基酸的开放阅读框[9]。陈莉等[10]通过RT-PCR技术筛检人类48种组织与相应肿瘤,发现除造血系统组织与相应肿瘤、心、脑、胰不表达外,几乎所有的人类组织及相应肿瘤均表达NET-1基因。本研究结果提示NET-1作为一种胞质蛋白可能可以传导细胞分裂的信息和/或引起细胞异向分化或去分化,它的过度表达与细胞增殖有关,可明显上调肺癌的恶性进展过程。作者分别对 NET-1和VEGF、EGFR进行了相关分析,结果显示NET-1与后两者在肺癌中的表达呈两两正相关,其原因可能是:一方面NET-1通过自身在细胞分化中所起的作用,促进了肿瘤细胞的增殖,而新生的肿瘤细胞又需要丰富的血供,进而刺激了细胞内VEGF表达的上调,导致血管新生,从而引起了恶性循环;另一方面,尽管TM4SF蛋白的生物学功能不十分清楚,但TM4SF与细胞黏附分子整合素的协同作用可特异性地调控后配体整合素依赖性信号转导,能影响黏附依赖性下游信号转导事件,包括细胞蛋白的酪氨酸激酶的磷酸化和丝氨酸、苏氨酸激酶PKB/c Akt的激活,进而影响细胞的运动和分化。在肺癌的发生、恶性进展中,EGFR作为一种酪氨酸激酶受体在其活化途径中有受到TM4SF蛋白调控的可能性。

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