十味板蓝根颗粒剂抗病毒作用的实验研究

司梁宏，陶 震，刘 静，刘 梅，邱 彦 （解放军454医院药剂科，江苏 南京 210002）

十味板蓝根颗粒是我院临床常用的自制中药制剂（南制字（2006）F54007号），由板蓝根、大青叶、金银花、连翘等十味中药材组成，主要用于感冒引起的发热、恶寒、头痛、流涕、咽痛等症。其方中君药板蓝根为十字花科植物菘蓝（Isatis indigoticaFort.）的干燥根，性寒味苦，具有清热解毒、凉血利咽的功效，临床上广泛用于治疗流感、病毒性肝炎、带状疱疹、腮腺炎等病毒感染性疾病。作为一种重要的抗病毒药物，板蓝根对多种病毒具有抑制感染及增殖的作用[1-4]。十味板蓝根颗粒所含其他主药均为清热解毒中药，研究其抗病毒作用可为临床应用提供参考依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

十味板蓝根颗粒（解放军454医院药剂科自制，规格：15 g/袋，批号 20080331）；阳性对照药：利巴韦林注射液（上海信谊金朱药业有限公司，1 mL∶100 mg，批号 080951）。

胰蛋白酶（Sigma公司）；DMEM培养基，MEM培养基（HyClone公司）；胎牛血清（杭州四季青有限公司）；细胞培养液为含有10%胎牛血清的DMEM；细胞维持液为含有2%胎牛血清的DMEM；常规加入100 u·mL-1的青霉素、链霉素（Sigma公司）。

1.2 细胞株与病毒株

Hep-2细胞株和Hela细胞株均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。柯萨奇病毒B3株（CVB3）和单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）均购自中国预防医学科学院病毒所。

1.3 实验仪器

CO2培养箱(美国Forma Scien-tific公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；超净工作台（上海值欧净化设备有限公司）；DL-360A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。

2 方法

2.1 溶液的制备

将十味板蓝根颗粒溶于维持液中，灭菌后配成浓度为100 mg·mL-1的溶液，按比例依次稀释成4000，2000，1000，500，250，125，63和31 µg·mL-1的溶液；利巴韦林注射液用维持液稀释至浓度分别为1000，500，250，125，63和31 µg·mL-1的溶液；溶剂对照组不加药物，加入细胞维持液。

2.2 病毒毒力测定

以细胞病变效应法（CPE法）测定50%组织细胞感染剂量（TCID50）。细胞病变率达50%及以上的培养孔为病变孔，细胞病变率小于50%者为非病变孔，根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50[5]。

2.2.1 CVB3病毒毒力测定 常规方法培养Hep-2细胞，将对数生长期的Hep-2细胞经胰酶消化后，制成5×104个·mL-1的细胞悬液，接种于96孔培养板，置5%CO2培养箱中37 ℃培养。待细胞长满单层后,每孔接种MEM培养基稀释的不同浓度（10-1～10-8）的CVB3病毒液。每个浓度接种8个孔，每孔0.1 mL，同时设正常细胞对照。于37 ℃吸附2 h后弃上清，加入细胞维持液连续培养96 h，每天于倒置显微镜下观察细胞病变程度（CPE），测定其TCID50。

2.2.2 HSV-Ⅱ病毒毒力测定 常规方法培养Hela细胞，将对数生长期的Hela细胞经胰酶消化后，制成5×104个·mL-1的细胞悬液，接种于96孔培养板，置5%CO2培养箱中37 ℃培养。待细胞长满单层后,每孔接种MEM培养基稀释的不同浓度（10-1～10-8）的HSV-Ⅱ病毒液。设复孔、对照及测定方法同“2.2.1”项。

2.3 药物的细胞毒性测定

将对数生长期的Hep-2细胞和Hela细胞消化计数后，接种于96孔培养板，待细胞长满单层后,分别加入8个不同浓度的十味板蓝根颗粒溶液（4000，2000，1000，500，250，125，63和31 µg·mL-1）和利巴韦林6个不同浓度的的药物溶液（1000，500，250，125，63和31 µg·mL-1），每个浓度4个孔，每孔0.15 mL，同时设正常细胞对照。置37 ℃，5%CO2培养箱中连续培养96 h，每天于倒置显微镜下观察细胞病变情况，测定药物的最大无毒浓度（TD0）[6-7]。

2.4 十味板蓝根颗粒剂的抗病毒实验

参考相关文献[6-7]进行实验。待96孔培养板Hep-2细胞长满单层后，每孔以100 TCID50的CVB3感染Hep-2细胞；在另一96孔培养板的Hela单层细胞内，每孔以100 TCID50的HSV-Ⅱ感染Hela细胞；于37 ℃吸附2 h后均弃去病毒液，分别加入6个不同浓度（1000，500，250，125，63和31 µg·mL-1）的十味板蓝根溶液和利巴韦林药液，每个浓度4个孔，同时均设溶剂对照、病毒对照及正常细胞对照，置37 ℃，5%CO2培养箱中连续培养96 h，每天于倒置显微镜下观察细胞病变，记录病变情况。当病毒对照达到“++++”时，判定结果，如果细胞对照生长良好，加入药物的细胞出现“+++”以上病变时，可判定该浓度的药物无抗病毒的作用。

3 结果

3.1 病毒毒力测定结果

以CVB3和HSV-Ⅱ的不同浓度（10-1～10-8）稀释病毒液分别接种培养细胞，观察细胞病变CPE（50%以上明显病变为细胞病变孔），计算CVB3病毒的TCID50为10-6.5，HSV-Ⅱ病毒的TCID50为10-5.7。

3.2 药物的细胞毒性测定结果

十味板蓝根颗粒剂对Hep-2细胞和Hela细胞毒性均较低，最大无毒浓度均为1 mg·mL-1；而利巴韦林在所设试验浓度下未观察到细胞毒性反应。细胞毒性镜检结果见表1。

表 1 十味板蓝根颗粒剂的细胞毒性结果Tab 1 Cytotoxicity effect of the compound radix isatidis granules to cells

3.3 十味板蓝根颗粒剂的抗病毒实验

实验结果表明：各浓度药物对CVB3和HSV-Ⅱ病毒均有一定的抑制作用，药物浓度在250、125和63µg·mL-1时，十味板蓝根颗粒剂对病毒致细胞病变可产生不同程度的抑制作用，但均不如利巴韦林。利巴韦林浓度500 µg·mL-1时可以完全抑制病毒所致细胞病变。十味板蓝根颗粒剂浓度在500 µg·mL-1以上时，可以明显抑制CVB3病毒对Hep-2细胞的致病变作用，抑制HSV-Ⅱ病毒对Hela细胞的感染致病变作用，对Hep-2和Hela细胞有保护作用，并且随着药物浓度的增加，CPE特征逐渐减弱，病毒抑制率（细胞存活率）明显升高。镜检结果分别见表2、表3。

表 2 十味板蓝根颗剂抗CVB3病毒感染Hep-2细胞的作用Tab 2 Antiviral activity effect of the compound radix isatidis granules to CVB3 in vitro

表 3 十味板蓝根颗粒剂抗HSV-Ⅱ病毒感染Hela细胞的作用Tab 3 Antiviral activity effect of the compound radix isatidis granules to HSV-Ⅱ in vitro

4 讨论

HSV-Ⅱ和CVB3均是引起呼吸系统感染的重要病原，可在婴幼儿和老年以及免疫缺陷人群引起严重肺炎，甚至危及生命。现有的病毒性疾病治疗药物主要是化学合成类，容易产生药品不良反应和耐药性。常用的抗病毒药物利巴韦林可以有效抑制CVB3等病毒复制，但其属于核苷类似物，毒性较大，而且还有致畸作用[8]。

十味板蓝根颗粒是由十味中药配伍而成的复方制剂，通过多种有效成分、多环节、多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效，其抗病毒作用是多种化学成分和机制综合作用的结果，可能是总生物碱的直接抑制病毒作用、多糖成分的促进免疫和抗体生成作用、醇提部位的抗炎和缩短病程作用、有机酸部位的抗菌和抗内毒素作用等[9]。

本实验采用病毒体外感染细胞模型，结果显示，十味板蓝根颗粒剂浓度在500 µg·mL-1时可明显抑制病毒感染致细胞病变作用，当浓度分别达到125µg·mL-1和250 µg·mL-1时,十味板蓝根颗粒剂显示出抗HSV-Ⅱ病毒感染Hela细胞和抗CVB3病毒感染Hep-2细胞的作用,提示十味板蓝根颗粒用于感冒的疗效基础可能与其抗病毒活性紧密相关。实验结果也表明，十味板蓝根颗粒剂的抗病毒整体效果不如利巴韦林好。但药理实验与临床已证实，十味板蓝根颗粒具有清热解毒利咽、抗菌抗病毒、解热镇痛及抗炎的功效；动物体内实验也证明，十味板蓝根颗粒能显著降低啤酒酵母所致的大鼠直肠温度升高，并能显著减少醋酸所致小鼠腹痛的扭体次数，同时显著延长小鼠热板的痛阈时间，具有显著的解热和镇痛作用[10]；对角叉菜胶及二甲苯所致肿胀有明显的抑制作用，能显著的抑制醋酸所致小鼠腹腔内炎性物质的渗出，对急性和慢性炎症均有明显的抑制作用[11]。

建议临床上考虑采用利巴韦林与十味板蓝根颗粒剂联合治疗上呼吸道感染，既能发挥利巴韦林抑制核糖核酸而达到广谱抗病毒作用，又能体现十味板蓝根颗粒剂清热解毒、凉血利咽、疏风解表的功效，具体的临床疗效、毒副作用及不良反应等情况，还有待于临床上进一步观察。

志谢：本研究中的抗病毒实验由南方医科大学药理学系徐江平教授课题组协助完成，特此表示感谢！

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