去甲斑蝥素对NCI-H446骨转移裸鼠模型的干预作用

高志棣 潘 琪 高 伟 马晓业 朱峰青

近年来中医药在骨转移癌的治疗中取得一些较好的疗效。中医药已经广泛应用于各类骨转移癌的治疗，充分体现了中医药既可止痛，又可抗癌，并能增强免疫及促进骨髓造血功能，提高抗病能力，减少放化疗毒副反应，明显改善晚期患者生存质量的防治优势。但是临床上有关中药治疗肿瘤骨转移实验研究的报道很少。去甲斑蝥素(norcantharidine，NCTD)是我国自行研制生产的新型抗肿瘤药物，是中药抗癌活性成分斑蝥素 (can，CA)去除1，2位两个甲基合成而得，具有显著的抗癌活性，其毒副反应较低，也是目前惟一具有升高白细胞作用的抗肿瘤药物，对常见肿瘤细胞的生长有抑制作用。本实验通过贴骨接种NCI-H446细胞制作骨转移裸鼠模型，检测其X线、生化及物理指标，并进行病理学分析，探讨去甲斑蝥素对肺癌骨转移抑制作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及材料 人小细胞肺癌细胞株NCI-H446(批号20100716)由南京凯基生物科技发展有限公司提供。完全RPMI-1640培养基(由南京凯基生物科技发展有限公司提供)，超级新生牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供。

小鼠I型前胶原C端肽(PICP)ELISA试剂盒、小鼠I型前胶原N端肽(PINP)ELISA试剂盒、小鼠骨涎蛋白(BSP)ELISA试剂盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。去甲斑蝥素钠(批号100701)由吉林一心制药股份有限公司提供。麻醉药物使用注射用盐酸氯胺酮(2ml∶0.1g)，硫酸阿托品(2ml∶1mg)，盐酸异丙嗪(2ml∶50mg)各1支，混匀。接种用注射针为美国B-D公司医用51/2号针。

1.1.2 主要仪器 X线机为日本TOSHIBA KXO-8ON，显微镜为日本Nikon Eclipse E600，层流架为江苏省苏州市吴县实验动物设施设备厂生产的SEL-1型。全自动酶标仪(Thermo MULTISKAN MK3，450nm、630nm)由芬兰Thermo absystems公司提供。

1.1.3 实验动物 由上海肿瘤研究所实验动物中心提供5周龄BALB/c-nu/nu雄性裸鼠(约20g/只)，按SPF级标准饲养于青岛大学医学院实验动物中心层流架内。

1.2 H446细胞骨转移动物模型的制作

细胞培养NCI-H446细胞株用含10%小牛血清、80U·ml-1青霉素、0.08mg·ml-1链霉素的 RPMI-1640完全培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每24h更换新鲜培养基1次。取指数生长期的H446细胞，经消化后，用无血清培养液调整细胞浓度为1×107个/ml。无菌条件下，实验组每只5周龄裸鼠于右后肢胫骨处肌肉下贴骨接种200μl细胞悬液(含2×106个细胞)。裸鼠继续饲养于层流架内，每周1～2次观察裸鼠生存状态及接种部位肿瘤生长情况。每周于固定时间检测小鼠体重，并观察肿瘤生长情况，按体重调整药量。

1.3 H446细胞骨转移动物模型的鉴定

X线摄片 细胞接种后2周及7周，取模型裸鼠腹腔注射氯胺酮50mg/kg麻醉，取其俯卧位行X线摄片(10mA，88kV，0.04s，靶片距为100cm)。

1.4 去甲斑蝥素对肺癌细胞骨转移的干预研究

实验10d后以肿瘤长径大于4mm为造模成功，63只实验裸鼠中有60只达造模标准，造模成功率为95%。将60只模型鼠随机分成3组，即对照组、低剂量药物组、高剂量药物组。对照组每天以100μl生理盐水灌胃。药物组应用制备的斑蝥提取液(无血清的RPMI1640培养基稀释的去甲斑蝥素钠溶液，终浓度为10μg/ml)进行灌胃，每日1次连续30d。低剂量药物组为102.4mg/kg。高剂量药物组为250mg/kg。

1.5 H446细胞骨转移动物模型生化特性的检测

在肺癌细胞H446接种后10d，将裸鼠麻醉，暴露腹部，下腔静脉取血，应用小鼠ELISA试剂盒及酶标仪检测血清PICP、BSP、PINP指标。接种7周后处死裸鼠，同时取血检测上述生化指标。

1.6 H446细胞骨转移动物骨破坏的病理分析

接种7周后处死裸鼠，分别取各裸鼠的右后肢，置于用10mmol/L PBS(pH7.2)配制的10%福尔马林中，固定72h。用水冲洗干净后，浸泡于14%ED-TA液中，脱钙处理2周。其间每隔1d更换EDTA液，并用摇床振荡。脱钙结束，流水冲洗2h，对标本行常规病理分析。

1.7 统计学处理

2 结果

实验观察各组小鼠一般状况良好，外观、大便均正常，未见毒副反应。

2.1 肺癌细胞骨转移的发生及鉴定

在肺癌细胞H446接种后10d，肉眼可观察到裸鼠的右后肢接种处生长出实体瘤，呈不规则形状，并随时间的延长逐渐突出增大，至一个月时已开始影响右后肢的活动功能。接种后2周经X线摄片检查发现，与自体左右肢胫骨比较，右后肢胫骨表面开始模糊，证明损伤。至7周时胫骨已接近溶断(见图)。接种8周后处死裸鼠，裸鼠右后肢经固定、脱钙等处理后，HE染色分析对肿瘤致骨损伤的影响。结果由图表明，H446肺癌细胞引起接种局部明显的骨破坏，部分严重者甚至已没有明显的骨组织存在，原有的骨组织被破坏后，在其周围有广泛的反应性骨生成，而骨髓中发现已有多处肿瘤细胞侵入。

2.2 去甲斑蝥素对肺癌细胞骨转移的干预

2.2.1 荷瘤小鼠肿瘤大小及重量比较 低剂量药物组肿瘤质量(0.985±0.167)g，体积(273.07±98.70)cm3;高剂量药物组肿瘤质量(0.739±0.153)g，体积(248.11±101.06)cm3;对照组肿瘤质量(1.129±0.188)g，体积(723.18±195.24)cm3。与用药组比较，对照组肿瘤生长快，质量、体积大，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2.2 3组小鼠体重的变化 每周于固定时间检测小鼠体重。与用药组比较，对照组小鼠体重增长明显缓慢，实验结束时低剂量药物组、高剂量药物组与对照组体重增长总量分别为(6.19±1.05)、(5.84±1.26)、(3.46±0.76)g，对照组显著低于用药组(P＜0.01)，而低剂量药物组与高剂量药物组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2.3 X片检查结果 在X片证实有肿瘤性骨损伤发生后，给予裸鼠去甲斑蝥素药物干预。其经X片检查显示，干预3周后，药物组裸鼠右后肢胫骨骨损伤病程与模型对照组相比被明显抑制，至接种后7周时，差异更加显著(见图示)。

2.2.4 血清PICP、BSP、PINP的检测 3组分别接种肺癌细胞H446后10d、7周检测血清PICP、PINP、BSP水平。结果发现各组骨转移早期PICP、PINP水平均明显升高，其中对照组骨转移晚期较早期PICP、PINP水平均明显升高(P＜0.01);低剂量药物组PICP水平明显升高(P＜0.01)、PINP水平略有增高(P＜0.05);高剂量药物组放射学检查显示晚期肿瘤性骨损伤组血清PICP、PINP水平升高均不明显(P＜0.05)，各组血清 BSP水平均升高(P＞0.05)。提示血清PICP、PINP水平升高对早期骨转移具诊断价值，对骨转移药物疗效监测有重要临床参考意义。

3 讨论

在世界范围内，无论是男性还是女性，肺癌已成为癌症死亡的主要原因［1］。近年来，随着我国社会经济的快速发展，城乡居民健康行为和疾病模式也发生了变化，恶性肿瘤死亡率居于世界较高水平，肺癌成为首位恶性肿瘤死因，30年来发病率劲升超过4倍。骨转移瘤是原发于其他脏器的恶性肿瘤经血运或其他途径转移到骨骼的肿瘤，是常见的肿瘤并发症之一。近年来，随着癌症发病率上升，骨转移瘤的发生率也逐年上升。约70%～80%的肿瘤可以发生骨转移，多数转移瘤的生物学行为表现比原发瘤更差，其生长速度更快［2］。肺癌是亲骨性肿瘤之一，所以极易发生骨转移，多宗报道肺癌骨转移发生率为30% ～40%，尸检发现肺癌骨转移发生率为44%［3］。在肺癌初次诊断时确定有骨转移者最多为腺癌，其次为小细胞肺癌和鳞癌。

骨转移瘤是一种肿瘤发生骨转移时肿瘤已经进展至晚期，所以治疗原则是缓解疼痛、预防和治疗病理性骨折，改善患者生活质量，延长生存期。骨转移临床治疗也相当棘手，西医主要采取手术、放化疗、内照射治疗、骨吸收抑制剂和内分泌等治疗，近期有一定疗效，但是毒副反应大，远期疗效不佳，因此常常需要以中药为主的辅助治疗来改善患者的生活质量。对那些体质状况差、不能耐受或者不愿意接受手术、放化疗的患者，则应采用以中医药辨证治疗为主的综合治疗方案。近年来中医药在骨转移瘤的治疗中取得了较大的进展，积累了一些较好的经验。目前中医药已经广泛应用于各类骨转移瘤的治疗，包括辨证施治、专方专药、外用药止痛及配合现代医学等多种治疗方法，均取得满意疗效。中医药防治该病的优势在于既可止痛，又可抗癌，并能增强免疫及促进骨髓造血功能，提高抗病能力，减少放化疗的毒副反应，明显改善晚期患者的生存质量。但是临床上有关中药治疗肿瘤骨转移的实验研究的报道很少［4］。

研究表明，斑蝥素能抑制肿瘤细胞的蛋白质合成，继而影响RNA和DNA的合成及细胞周期的进程［5］，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。斑蝥素还具有较强的抗肿瘤细胞侵袭和转移的作用［6］。去甲斑蝥素是由呋喃及顺丁烯二酸酐通过Diles-Alder加成反应后经催化加氢合成制得。去甲斑蝥素的作用和斑蝥素相似，也可抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，并具有抗肿瘤细胞侵袭和转移的能力。去甲斑蝥素对体外培养的多种肿瘤细胞均有明显的杀伤作用［7～13］，是一种新型的抗肿瘤中药，并且具有独特的升白细胞功能［14］，是国际上第一个有升高白细胞作用的抗癌药物［15］，主要用于治疗肝癌、食管癌和胃癌，但是去甲斑蝥素对骨转移癌的实验研究国内外均未见报道。本实验从病理、影像学及生化水平等几个方面充分证明了去甲斑蝥素对肿瘤生长的抑制作用，并得出高剂量去甲斑蝥素对肿瘤体积增大、骨破坏进展的抑制作用明显好于低剂量组的结论，但此观点需临床进一步观察证实。

目前诊断骨转移最直接的方法是骨活检，但该法为有创操作，患者大多难以接受，不能短时间内多次进行。X线、ECT、CT和MRI检查是诊断骨转移的常用手段。X线敏感性低，当骨转移灶直径≥1～2cm、局部脱钙量达30% ～50%时，X线才能发现骨小梁的破坏性病变。ECT可早于X线检查3～6个月发现骨损害，但特异性低，且存在反跳现象，短时间内不能区分是治疗有效还是骨转移进展。CT、MRI适合骨扫描阳性而X线阴性的患者明确病变［16］。上述检查费用高、需要时间积累、有辐射危害等限制，不便于经常性地监测骨代谢的动态变化。随着对肿瘤性骨病发病机制研究的不断深入，应用某些骨代谢指标微观性地评价骨损害的程度，可判断骨转移的病情变化是否有临床实际意义。血清骨代谢生化指标PICP、PINP的检测对骨转移的诊断意义临床报道较少，对其在早期诊断的价值研究国内尚未见相关报道，本研究为临床早期诊断骨转移提供了较好的理论基础，实验同时验证了血清PICP、PINP水平对抗骨转移药物疗效监测的重要作用。

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