盐城地区鹅致病性大肠杆菌的分离与鉴定

朱明 陈静华 纪家玉 裔群英 卞红春 高 崧 彭大新

（1 江苏省盐城市畜牧兽医站 江苏盐城 224002 2 扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室 江苏扬州 225009）

鹅大肠杆菌病是由大肠杆菌引起，广泛流行于各鹅场，其中产蛋母鹅的卵黄性腹膜炎又称为“蛋子瘟”。该病常随着鹅产蛋而开始，产蛋停止而结束。患此病的鹅群产蛋下降，有死亡。在孵蛋期间出现大量死胚蛋。患病母鹅精神萎靡，拉白色稀粪，卵泡膜充血、易破裂，输卵管内有大量白色干酪样蛋白凝固块，有臭味。泄殖腔黏膜充血、出血。腹腔内广泛性腹膜炎，有黄色干酪样物。患大肠杆菌病的公鹅则表现阴茎充血、肿大，表面溃疡、坏死，在不同部位有数量不等的结节，不愿交配[1～3]。为了给盐城地区养鹅场的特异性防治措施的制定提供依据，笔者对该地区的鹅大肠杆菌病的发生、血清型的类型及分布情况进行了调查，现将有关内容报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 盐城地区的建湖、大丰、盐都、射阳、滨海、东台、亭湖、阜宁、响水和市开发区共10个县(市、区)临诊上获取有典型大肠杆菌病变的病、死母鹅221只，发病公鹅83只。从鹅炕坊采集死胚蛋356枚。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、尿素、硫化氢和蛋白胨水等生化发酵培养基、麦康凯干粉培养基为上海市医学化验所试剂厂产品。

1.1.2.2 柠檬酸盐培养基、葡萄糖蛋白胨水和明胶培养基参照文献[4]配制。

1.1.2.3 血清型鉴定所用营养琼脂斜面、营养肉汤参照文献[4]配制。

1.1.2.4 半固体培养基：肉汁1000mL，蛋白胨10g，磷酸氢二钾1g，氯化钠5g，琼脂5g，调整pH至7.4～7.6，高压灭菌121℃，10min,冷却至50℃分装试管。

1.1.3 大肠杆菌标准抗O血清 中国兽药监察所制备，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离

1.2.1.1 从患病公鹅的阴茎结节、患病母鹅的泄殖腔黏膜、输卵管分泌物、病死鹅的肝、十二指肠、卵泡、输卵管及种鹅所产蛋孵化后死亡胚的卵黄用麦康凯培养基分离细菌。

1.2.1.2 无菌操作采取上述病、死鹅的病料和死胚蛋划线于麦康凯斜面，37℃培养24h，再纯培养后选取单个典型菌落用液体石蜡覆盖法保存。

1.2.2 革兰氏染色镜检 用接种环挑取一环生理盐水蘸于洁净玻片上，再用接种环挑取少量纯化后的细菌与玻片上的生理盐水混合，并均匀涂布于玻片上，自然干燥后用火焰固定；在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗；加革兰氏碘溶液于玻片上媒染，作用1min，水洗；再加95%酒精脱色，作用30～60s，水洗；加中性红复染1min，水洗。自然干燥后镜检，观察细菌染色与形态。

1.2.3 生化试验 对所有分离株进行葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、吲哚、硫化氢、脲酶、M.R、V-P、枸橼酸盐和明胶液化10项生化指标的测定。

1.2.4 血清型鉴定 将待检菌株在琼脂斜面上培养24h，用5g/L石碳酸生理盐水洗下菌落（细菌数大于210个/mL），然后以121℃高压2小时即制成O抗原。所有分离株首先经玻板凝集试验初步筛选可能的O血清型，可疑的通过试管凝集试验确定其O血清型。定型的标准为血清的试管凝集价不小于1∶640[1]。

2 结果

2.1 细菌分离镜检

表1 256个分离株的10项生化试验结果

表2 不同地区、不同样品鹅大肠杆菌的分离情况

表3 不同部位鹅大肠杆菌的分离情况

从病、死公、母鹅304只及死胚蛋356枚中共分离细菌293株，其中256个分离株在麦康凯培养基上长出大小一致的粉红色小菌落，无杂菌生长。革兰氏染色镜检，256个分离株均为两端钝圆的革兰氏阴性小杆菌。

2.2 生化试验

256个分离株的10项生化试验结果完全符合大肠杆菌生化特性的分离株占多数，极少数菌株在个别项目上不符[5、6]，详见表 1。

2.3 不同地区、不同来源的样品的分离情况

从母鹅分离到136株，分离率为61.5%；从公鹅分离到79株，分离率为95.2%；从鹅炕坊死胚蛋中分离到41株，分离率为11.5%。所分离细菌分布情况详见表2。

2.4 不同部位样品分离情况

患病母鹅的泄殖腔、患病公鹅的阴茎结节和病、死母鹅的十二指肠、输卵管或卵泡容易分离到细菌，病死母鹅的肝脏器官上和死胚蛋中不容易分离到细菌。不同部位的分离结果详见表3。

2.5 血清型鉴定

256个分离株中有50株未能定型，自凝株9株，其余197株血清型从多到少依次为O1（13.3%）、O107（11.7%）、O141（8.2%）、O9（5.9%）、O78（5.5%）、O7（5.5%）、O36（5.5%）和O8（3.5%），详见表4。

3 讨论

3.1 鹅大肠杆菌病是严重危害养鹅业健康发展的传染病之一。本次流行病学调查的对象主要是成年鹅及其所产蛋的孵化胚，调查的结果表明本病从性成熟开始发生，其传播速度较慢。患有本病的鹅群中，公鹅阴茎上可发现结节，并从其中分离到与患病母鹅同一血清型的大肠杆菌。因此，可以认为感染公鹅与母鹅的大肠杆菌是属于同一种来源。在母鹅未发病之前，检查13群公鹅阴茎有病变者，结果有12群鹅发生本病，说明患病公鹅在传播本病上起了重要作用。另外在鹅群所产蛋的孵化死胚中分离到相同血清型的大肠杆菌，说明大肠杆菌还可以通过卵进行垂直传播感染［3］。

表4 不同地区256个分离株的血清型的分布情况

3.2 患病母鹅的泄殖腔，患病公鹅的阴茎结节，病、死母鹅的十二指肠、输卵管或卵泡容易分离到细菌，但不是所有的病例都能分离到，尤其是用过药物的鹅群。病死鹅的肝脏上不容易分离到细菌。

3.3 通过分离、染色镜检和生化试验鉴定，本次试验获得了256株大肠杆菌。生化试验结果表明，完全符合大肠杆菌生化特性的分离株占多数，极少数菌株在个别项目上不符。因此，在作大肠杆菌的生化鉴定时，应多设一些有针对性的检验项目，以便在个别项目不符时，不致误判。

3.4 盐城市10个县（市、区）256个鹅源性大肠杆菌分离株中，共测出197个分离株的血清型，其种类(血清型) 达 21 个之多，但以 O1、O107、O141、O9、O78、O7和O36为主，共142株，占定型菌株的72.1%；前3种血清型在种类上仅占总量的1/7，却拥有85个分离株，占定型菌株的43.1%。因此，在本次调查中，O1、O107和O141等3个血清型为优势血清型。

3.5 高崧等对我国18个省市的禽大肠杆菌分离鉴定表明，O18、O78、O2、O88、O11和 O26等 6 个血清型为优势血清型[7、8]。而我们分离的大肠杆菌的血清型主要为 O1、O107、O141、O9、O78、O7和 O36，同时存在着优势血清型，与其他地区的血清型也有一定差异[9～11]。如样品较多 (定型菌株20个以上)的4个地区，O1、O107和O141分离株数大多在前5位内，且Ol血清型列于其中3个地区的首位。多样性体现在：197个定型菌株覆盖了21个血清型。因此盐城地区鹅大肠杆菌分离株存在地区性、多样性，这对于当地鹅大肠杆菌病的特异性防制有重要指导意义。

3.6 根据256个鹅源大肠杆菌分离株的检测结果，笔者认为，在当地门诊量大的兽医站、门诊部采样比在少数几个鹅场采样更具代表性。样品量大的代表性强；反之，代表性弱。

[1]曹澍泽，郭玉璞，董国雄，等主编.兽医微生物学及免疫学技术.北京：北京农业大学出版社，1992：34-95.

[2]甘肃农业大学主编.兽医微生物学.北京中国农业出版社，1999：209-230.

[3]CalnekBW主编.禽病学(第9版).高福，刘文军主译.北京：北京农业大学出版社，1991：126-132.

[4]甘肃农业大学主编.兽医微生物学实验指导.北京：中国农业出版社，1999：81-87.

[5]霍龙飞，毕丁仁.湖北省鸡源致病性大肠杆菌某些生物学特性研究.中国畜禽传染病，1995(1)：23-26.

[6]韦平，李康然，施万球.广西鸡大肠杆菌的分离与鉴定.广西农学院学报，1989，8(2)：31-380.

[7]高崧等.我国部分地区禽源性大肠杆菌的分离与鉴定.畜牧兽医学报，1999，30(2)：164，171.

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[9]王晶钰，张国祥，王荚珍，等.陕西省鸡致病性大肠杆菌的分离及血清型鉴定和药敏试验.中国兽医科技，1996，26(3)：15-17.

[10]张春荣，苏亚拉图.我国流行的鸡致病性大肠杆菌血清型.中国动物检疫，1996，13(1)：27.

[11]夏业才，潘松年.禽大肠杆菌病研究-鸡致病性大肠杆菌血清型鉴定.中国兽药杂志,1991，25(4)：1-2.