安脑片对aGVHD小鼠Th1/Th2细胞的调节作用①

2011-07-30吴顺杰广东省中医院血液科广州510120

中国免疫学杂志 2011年10期

吴顺杰 (广东省中医院血液科,广州510120)

辅助性T细胞(Th)及其分泌的细胞因子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生、发展及维持的过程中起着至关重要的作用[1],按其分泌的细胞因子的不同,Th亚群分为Th1和Th2。调整Th1/Th2细胞因子的平衡在防治aGVHD中具有良好的临床应用前景。笔者在以往的论文中指出解毒法是中医药防治aGVHD的重要治疗原则,应贯穿aGVHD治疗的始终[2]。在本研究中,笔者以aGVHD小鼠为模型,应用具有清热解毒作用的中药安脑片干预治疗后,观察小鼠外周血液中的细胞因子IFN-γ和IL-10水平以及肝脏组织中IFN-γ和IL-10阳性表达情况的变化,以探讨aGVHD小鼠Th1/Th2的表达情况及安脑片对Th1/Th2细胞因子的影响,以期揭示安脑片干预aGVHD发生的免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组实验动物为广州中医药大学实验动物中心提供。供鼠:清洁级BALB/c H-2d小鼠10只,8～ 10周龄,雄性,体重(20±2)克 ;受鼠:清洁级C57BL/6 H-2b小鼠 20只,10～12周龄,雌性,体重(20±2)克。小鼠在广州中医药大学动物中心SPF级动物房内笼中饲养。

1.2 药剂制备安脑片:哈尔滨东方制药生产,薄膜衣片,0.5 g/片,主要成份:人工牛黄、水牛角浓缩粉、猪胆汁粉、黄连、黄芩、郁金、珍珠母、珍珠、雄黄、冰片、朱砂、薄荷脑等15味药物组成,攻效:清热解毒。上药购自广东省中医院中药房,生产批号为:20100701,灌胃前用0.9%生理盐水临时配成药液,配药浓度为0.1 g/ml。分装成100 ml瓶备用,以便动物灌服。

1.3 模型制作、分组及处理将20只C57BL/6小鼠按照文献[3]的方法制作模型,然后随机分为空白组及安脑片组,每组10只,处理如下:(1)安脑片组:小鼠给予安脑片药液0.2 ml/只,每天分2次灌胃,从移植后第1天开始用药,用至第30天。(2)空白组的处理:均给予0.9%生理盐水灌胃,用法、用量、次数、给药天数与其他3组相同。第30天断颈处死,留取标本用于检测,空白组小鼠则在小鼠濒临死亡时留取标本。

1.4 主要仪器与试剂 ELISA检测试剂盒(法国Diaclone公司)。兔抗人白细胞介素(IL)-10、干扰素(IFN)-γ单克隆抗体以及SABC试剂盒(武汉博士德生物工程公司)。磷酸盐缓冲液(PBS),倒置相差显微镜(Leica公司)。二氧化碳培养箱(Thermo公司,美国)。OLYMPUS倒置显微镜(CK-2,日本)。OLYMPUS照相系统(PM-CBAD,日本),病理切片机。PPCT-ZB型超声波多功能快速组织脱水机(襄樊徕卡生物电子仪四厂生产)。OCT包埋剂。

1.5 ELISA法检测小鼠血清IFN-γ及IL-10水平

严格按试剂盒和酶标仪说明书提示的步骤进行操作,具体操作如下:(1)移植后第30天,取小鼠眶静脉血,离心后取其上清。(2)酶标的生物素抗体。(3)加入酶的底物发生显色反应。(4)酶标仪450 nm读取吸光度(A)值。(5)通过标准品曲线计算样品的IFN-γ和IL-10的含量。

1.6 免疫组化法检测肝脏组织IFN-γ及IL-10的阳性表达

1.6.1 免疫组化标本的制作移植后第30天,取两组小鼠肝脏各2块,放入10%中性甲醛固定,丙酮脱水、石蜡包埋,全部蜡块均行4μm连续切片。切片常规脱蜡,梯度乙醇水洗,3%甲醇过氧化氢去除内源性过氧化物酶,室温置10分钟,PBS冲洗。滴加正常山羊血清,37℃30分钟。滴加一抗4℃过夜(一抗浓度为1∶100),PBS冲洗。滴加生物素化二抗,37℃孵育30分钟,PBS冲洗。加SABC液37℃1小时,PBS冲洗。DAB显色,室温下 3～10分钟。水洗,苏木素复染,脱水,透明,明胶封片。

1.6.2 结果判定通过两位有5年以上经验的临床病理学家采用双盲法判断结果,每张切片选择有代表性的区域,并避开切片周边区域,观察组织IFN-γ、IL-10的阳性表达,根据阳性细胞百分数和染色强度进行分级[4]。两组计分相加,0～1分为阴性,2～3分为弱阳性,4～5分为阳性,6～7分为强阳性。阳性分级见表1。

2 结果

2.1 小鼠血清中 IFN-γ、IL-10表达治疗前,两组小鼠IFN-γ的表达分别为(9.56±0.71)pg/ml与(9.67±0.88)pg/ml,经统计学分析无明显差异(P=0.345),经安脑片干预治疗后,安脑片组小鼠血清IFN-γ的表达降为4.81±0.87,与治疗前相比差异显著(P=0.000),而空白组IFN-γ的表达水平下降不明显(P=0.597),见表2。

治疗前,两组小鼠IL-10的浓度分别为(3.62±0.59)pg/ml和(3.81±0.55)pg/ml,差异无显著性意义(P=0.524)。安脑片治疗后,IL-10的表达升至(8.16±0.92)pg/ml,与治疗前相比,差异显著(P=0.000)。而空白组IL-10的表达水平变化不大(P=0.150),见表 3。

2.2 免疫组化法检测小鼠肝脏IFN-γ的表达

表1 免疫组织化学阳性分级Tab.1 Tissue immunochemical score criteria

2.2.1 小鼠肝脏组织IFN-γ的表达 aGVHD小鼠肝脏炎性细胞胞浆IFN-γ的表达呈现棕黄色颗粒状物质,阳性细胞占95%以上,提示病理组织 IFN-γ的表达呈现强阳性反应(图1A)。经安脑片治疗后,小鼠肝脏炎性细胞胞浆IFN-γ的表达呈现淡黄色颗粒状物质或未染色(图1B),阳性细胞约占5%～10%。

2.2.2 小鼠肝脏组织IFN-γ的表达评分结果治疗前两组肝脏IFN-γ的表达评分分别为3.73±0.46和3.80±0.41,两组间的差异无显著性意义。经安脑片治疗后,安脑片组小鼠IFN-γ的表达评分降为1.27±0.46,与治疗前相比,差异有显著性意义(P=0.000)。空白组IFN-γ的表达则变化不明显(P=0.189),见表 4。

2.3 免疫组化法检测小鼠肝脏IL-10的表达

2.3.1 小鼠肝脏 IL-10的表达 aGVHD小鼠肝脏炎性细胞胞浆IL-10的表达呈现淡黄色或浅黄色颗粒状物质,阳性细胞约占10%～40%,提示肝脏组织IL-10的表达呈现弱阳性或阴性反应(图2A)。经安脑片治疗后,安脑片组小鼠肝脏炎性细胞胞浆呈现棕黄色或棕褐色,阳性细胞约占80%～95%(图2B),呈现强阳性反应。

2.3.2 小鼠肝脏组织IL-10的表达评分结果治疗前两组肝脏IL-10的表达评分分别为1.27±0.46和1.20±0.41,两组间的差异无显著意义。经安脑片治疗后,安脑片组小鼠IL-10的表达评分升至3.73±0.46,与治疗前相比差异显著(P=0.000)。空白组IL-10的表达有所上升,但与治疗前相比,差异不明显(P=0.055),见表 5。

表2 两组小鼠血清中IFN-γ的表达水平(±s,pg/ml)Tab.2 Expression of IFN-γin blood serum sample of two group( ±s,pg/ml)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 9.56±0.71 9.64±0.72 -0.542 0.597 Control group 15 9.67±0.88 4.81±0.87 17.768 0.000

表3 两组小鼠血清中IL-10的表达水平±s,pg/ml)Tab.3 Expression of IL-10 in blood serum sample of two group±s,pg/ml)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 3.62±0.59 3.77±0.50 -1.522 0.150 Control group 15 3.81±0.55 8.16±0.92 -13.557 0.000

表4 两组小鼠肝脏IFN-γ的表达阳性评分±s)Tab.4 Immunochemical positive scoring results of IFN-γin liver sample of mice(±s)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 3.73±0.46 3.53±0.52 1.382 0.189 Control group 15 3.80±0.41 1.27±0.46 19.000 0.000

图1 小鼠肝脏IFN-γ的表达(HE,×400)Fig.1 Expression of IFN-γin liver sample of mice(HE,×400)

图2 小鼠肝脏IL-10的表达(HE,×400)Fig.2 Expression of IL-10 in liver sampleof mice(HE,×400)

表5 两组小鼠肝脏IL-10的表达阳性评分(±s)Tab.5 Immunochemical positive scoring results of IL-10 in liver sample of mice(±s)

Groups Number Before treatment After treatment t P(2-tailed)Blank group 15 1.27±0.46 1.60±10.51 -2.092 0.055 Control group 15 1.20±0.41 3.73±0.46 -13.201 0.000

3 讨论

IFN-γ是参与aGVHD第二步骤的关键因子,它在aGVHD的早期阶段产生,能上调MHC和粘附分子表达,激活单核细胞发挥抗原提呈作用,诱导CD4+淋巴细胞分化成熟,增加Ⅰ类细胞因子的分泌,激活CTL,加强同种异体抗原刺激下的混合淋巴细胞反应[5]。但 Welniak 等[6]和 Jean-Sébastien Delisle等[7]的研究发现,IFN-γ在aGVHD致死方面起保护作用。我们的研究结果显示:发生aGVHD后,两组小鼠血清IFN-γ的表达水平上升,分别为(9.56±0.71)pg/ml与(9.67±0.88)pg/ml,这与文献[8,9]报道的情况相似。免疫组织化学的研究结果显示,aGVHD小鼠肝脏组织中IFN-γ的表达呈现棕黄色颗粒状物质,阳性细胞占95%以上,两组小鼠肝脏IFN-γ的表达评分分别为 3.73±0.46和3.80±0.41,两者的差异并不显著,这与以往的文献报道基本一致[10]。而在安脑片治疗后,小鼠血清IFN-γ的表达降至(4.81±0.87)pg/ml,小鼠肝脏组织IFN-γ的表达呈现淡黄色颗粒状物质或未染色,阳性细胞约占5%～10%,呈现弱阳性反应,其表达评分也降为1.27±0.46,与治疗前相比,差异显著(P=0.000)。这说明安脑片在降低aGVHD小鼠血清IFN-γ的表达水平及肝脏组织IFN-γ的阳性表达方面起积极作用。

IL-10是由活化的巨噬细胞、B细胞和Th2细胞产生,具有下调Th1类细胞因子的作用,可抑制单核巨噬细胞的炎症效应及IL-2、IFN-γ、TNF-α等Th1类细胞因子产生[11],还可通过下调单核细胞表面MHCⅡ类分子和T淋巴细胞激活所必需的共刺激分子B7的表达而抑制其抗原提呈功能的发挥[12],因此上调IL-10表达水平,抑制IFN-γ等Th1类细胞因子产生,是阻止aGVHD发生和发展的策略之一。本研究的结果显示:发生aGVHD后,小鼠血清中IL-10的表达水平降低,分别为(3.62±0.59)pg/ml和(3.81±0.55)pg/ml,两组的浓度变化不明显。免疫组化显示小鼠肝脏组织中IL-10的表达呈现淡黄色或浅黄色颗粒状物质,阳性细胞约占10%～40%,其表达评分分别为1.27±0.46和1.20±0.41,提示移植小鼠发生aGVHD后IL-10的表达水平是下降的,这与文献[13]的报道一致。而经过安脑片治疗后,IL-10表达升至(8.16±0.92)pg/ml,小鼠肝脏组织呈现强阳性反应,阳性细胞约占80%～95%,其表达的评分也升至3.73±0.46,与治疗前相比差异显著(P=0.000),这提示安脑片可提高aGVHD小鼠IL-10的表达水平。

由此看出,安脑片通过降低aGVHD小鼠IFN-γ的表达,同时提高IL-10的含量,从而保持了Th1/Th2细胞间的平衡,调节和控制aGVHD的发生。为什么具有清热解毒作用的安脑片能够调节Th1/Th2细胞间的平衡呢?笔者从其组成药物的现代药理研究来解释。中药的现代药理研究表明,方中雄黄具有解毒、杀虫、燥湿、祛风等功能,其主要成分为四硫化四砷(AS4S4)和三硫化二砷(AS2S3),能够抑制大鼠血清中炎性细胞因子TNF-α等Th1类细胞因子的释放[14]。牛黄的主要成分牛磺酸,具有解热镇痛等功效,对炎症的各个阶段均有显著的抑制作用,可提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能[15]。安脑片中还有水牛角、黄芩、黄连、珍珠等药物,对炎症细胞因子如TNF-α、IFN-γ等都有明显的抑制作用[16-19]。正是安脑片组成药物及其成分对炎症细胞因子的抑制作用,减少了细胞因子的产生或功能的发挥,起到明显干预aGVHD的效果。至于安脑片干预小鼠aGVHD效应是否存在其他机制,需要进一步研究证实。

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