针刀干预下小白鼠正常骨骼肌及筋膜微观结构变化的实验研究

齐丹丹，李殿宁，李开平，芦 娟，王 丹

(南京中医药大学，江苏南京210046)

自1976年朱汉章发明针刀以来，应用针刀治疗软组织损伤性疾病取得了良好的临床疗效。朱汉章认为［1］针刀医学是一种精密的体外操作的微创手术方法。但是，对于针刀干预下骨骼肌及筋膜的组织学微观结构变化，目前尚无文献报道。笔者在南京中医药大学李殿宁导师指导下，观察针刀干预下损伤组织自发的一系列炎症修复过程，以及探讨针刀医学治疗学的基础机理，采用组织学HE染色方法，从骨骼肌及筋膜微观结构入手进行了相关的实验研究。现将实验研究情况报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象 选择小白鼠(18 g±2 g)26只，均由南京中医药大学实验动物中心提供，随机分为5组:空白对照组2只，针刀干预组1、针刀干预组2、针刀干预组3和针刀干预组4各6只，并对每组小白鼠依次进行编号。

1.1.2 实验器材 针刀0.4 mm×40 mm、饲养笼5个、无菌手套若干、饲料、垫料、照相机(像素1 000万)、剪刀、碘酒、75%酒精、创可贴、自制固鼠板2个，无水乙醇(分析醇)、10%福尔马林溶液(4%甲醛溶液)，TSJ－Ⅱ型全自动脱水机、BMJ－Ⅲ型包埋机、BMJ－Ⅲ病理组织包埋冷冻台、石蜡切片机、QP－9切片漂烘温控仪(常州郊区中威电子仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 空白对照组 将该组小白鼠捆绑固定，对股部大转子下定点部位去毛、消毒后，取该处肌肉组织一块，其长、宽约为0.5～1.0 mm、厚度约为1.0 mm，制作出石蜡切片后，于显微镜下观察切片中骨骼肌的正常形态。

1.2.2 针刀干预组 参照人体针刀治疗四步操作法［2］进行针切。以针刀干预组1为例，先将针刀干预组1的小白鼠依次固定于固鼠板上(腹部向下，背部向上)，然后按照:定点——在小白鼠后腿伸直位股骨大转子下定位为进针点标记后消毒;定向——针刃方向与局部骨骼肌纤维、血管神经走向一致，避免针刃损伤深部组织结构;加压——以左手拇指为押指，在进针点下按压;进针与针切——用针刀(型号为0.4 mm×40 mm)迅速刺入进针点皮下组织层达骨骼肌部位，并对病变部位行使纵向稍有间隔的连续切割3～5次后出针。比照针刀干预组1的干预方法，对针刀干预组2、针刀干预组3和针刀干预组4的小白鼠依次进行针刀干预。

1.2.3 针刀干预后的HE染色 将针刀干预组1、针刀干预组2、针刀干预组3和针刀干预组4小白鼠分别于针刀干预1 d、2 d、5 d和10 d后拉颈断髓处死。然后，以各小白鼠针刀针切进针点为中心，取相同部位肌肉组织一块，其长、宽约为0.5～1.0 mm，厚度约为1.0 mm，将组织块放于4%甲醛溶液内固定24 h后制作出石蜡切片，显微镜下观察针切部位骨骼肌切片中组织结构改变情况。

2 结果

利用组织学HE染色技术［3］，观察到正常骨骼肌经针刀干预后在不同时间段所呈现的微观结构变化如图1～图4所示。其中:图1针刀干预组1(针刀干预1 d后)，在损伤部位可以观察到:针切部位有肌纤维断裂，肌组织与肌组织之间的结缔组织即筋膜出现大量与肌细胞核大小、嗜碱性程度、部位均不同的炎症细胞，且以成纤维细胞和巨噬细胞为主，并伴有红细胞存在;图2针刀干预组2(针刀干预2 d后)，在损伤部位可以观察到:肌纤维损伤，且在受损的肌细胞之间结缔组继续产生以巨噬细胞为主的炎症反应，并伴有红细胞存在;图3针刀干预组3(针刀干预5 d后)，在损伤部位可以观察到:结缔组织出现的巨嗜细胞处于消退状态，有新生成的毛细血管、红细胞存在;图4针刀干预组4(针刀干预10 d后)，在损伤部位可以观察到:结缔组织填充在针切部位，并没有形成肉芽组织或瘢痕组织。

图1 40倍 针刀干预组1(针切后1天)

图2 40倍 针刀干预组2(针切后2天)

将空白组(如图5所示)与针刀干预组(如图1～图4所示)比较，可以将观察结果概括为:小白鼠股部大转子下定点部位的正常骨骼肌及筋膜组织经针刀干预后，出现了以血管为中心、巨噬细胞聚集的反应性炎变，以及之后发生的一系列修复过程，修复结果趋向于正常骨胳肌及筋膜结构。

3 讨论

针刀针切软组织导致肌与筋膜组织的连续性中断并出现针切反应性炎变，其反应主要表现为针切后的1 d和2 d内，针切部位出现以血管为中心、大量巨噬细胞和成纤维细胞聚集及红细胞溢出情况，发生炎性细胞浸润，成纤维细胞活跃［4～5］，炎性细胞的浸润可生成过氧化物(H2O2)，而一氧化氮可降低因H2O2激活的白细胞的侵袭性，保护肌细胞结构与功能的完整性［6～8］。巨噬细胞的大量产生对损伤的修复起到3个重要作用:第一，巨噬细胞的产生可以吞噬细胞碎片、坏死组织和少量细菌，起到“清道夫”的作用［9］;第二，巨噬细胞对于血管生成也有重要作用，巨噬细胞的大量增多促进了局部毛细血管的生成，为局部缺血缺氧的骨骼肌重建提供了良好的血运;第三，据现代医学研究发现，巨噬细胞吞噬细胞碎片的同时可以分泌生长因子，从而激活肌肉组织存在于肌纤维膜和基膜之间的再生性干细胞——卫星细胞。肌卫星细胞的聚集和激活是肌组织再生的关键。针刀针切5 d后巨噬细胞消退，受损肌纤维修复情况良好，有新生毛细血管出现。经过10 d修复，干预部位的骨骼肌和筋膜经过一系列修复过程，趋向于正常组织，修复情况良好。

图3 40倍针刀干预组3(针切后5天)

图4 40倍针刀干预组4(针切后10天)

图5 10倍正常骨胳肌

笔者观察针刀干预小鼠股部定点部位后骨骼肌和筋膜结构的变化规律，发现在针刀干预后小鼠的肌组织和筋膜组织修复情况良好，无中性粒细胞出现的感染情况。虽然小鼠皮肤的结构不同于人体，无法观察皮肤的愈合情况，但是根据外科学研究推断，针刀在进行治疗的过程中，因严格遵循外科手术的无菌操作，无代表炎症反应的中性粒细胞等出现，针刀干预人体皮肤后所形成的自身组织修复是创口小、清洁、无感染、不产生或很少产生肉芽组织的愈合，属于伤口一期愈合［10］。笔者认为针刀针切过程，尽管是对皮肤、皮下组织、骨骼肌和筋膜连续性的破坏过程，但同时可以达到骨骼肌的再生而重建原有的正常结构与功能，完全性病理性再生［11］。可分化的细胞，在基因的调控下分化发育成为不同种类的组织和器官。

4 结论

为了填补针刀治疗的相关实验研究，笔者观察针刀干预小白鼠正常组织后，HE染色观察小鼠骨骼肌的微观结构变化可以概括为:针切反应性炎变－基因调控－组织重建过程，即针刀针切组织可在基因调控下定向修复和重建，从而恢复病变组织的重建过程。这一结论为针刀医学治疗学的基础机理研究提供了形态学依据，具有积极的意义。

［1］朱汉章.针刀医学原理［M］.北京:人民卫生出版社，2002:26－29

［2］李殿宁.针刀诊断与治疗精要［M］.北京:北京华夏出版社，2007:25－26

［3］徐维荣.组织学实验技术［M］.北京:科学出版社，2009:1－15

［4］高巍巍，李殿宁，丁月东.针刀治疗臀小肌肌筋膜炎临床方法和机理研究［J］.中医药信息，2011，28(3):111

［5］范小涛，李殿宁.针刀治疗股神经卡压综合征的探讨与分析［J］.中医药信息，2010，27(3):75

［6］Tomball JG，Wehling－Henricks M.Macrophages promote muscle membrane repair and muscle fibre growth and regeneration during modified muscle loading in mice in vivo［J］.J Physiol，2007，578(Pt 1):327－336

［7］车力龙，欧阳驰，肖德生.长期耐力运动对大鼠腓肠肌的损伤及一氧化氮的调节作用［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(49):8294－8298

［8］蒋璐，车力龙，肖德生.长期游泳运动对大鼠心肌脂质过氧化应激反应和抗过氧化作用影响的性别差异［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11(47):9475－9477

［9］成令忠.现代组织学［M］.上海:上海科学技术文献出版社，2008:185－189

［10］吴阶平.黄家驷外科学［M］.北京:人民卫生出版社:2008:70－75

［11］Da Silva M，Trafton PG.Bilateral femoral neck stress fractures in An amenorrheic athlete［J］.Am J Orthop，2001，30(9):768－774